[發明專利]Sip基因重組載體、殼聚糖?PLGA包裹Sip基因DNA疫苗及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610415590.3
• 申請日: 2016-06-14
• 公開（公告）號: CN107502622A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 馬艷平;梁志凌;柯浩;劉振興;郝樂;馬江耀
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院動物衛生研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;A61K48/00;A61K39/09;A61P31/04
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司44224
• 代理人: 曾鳳云,萬志香

1.一種羅非魚無乳鏈球菌Sip基因真核表達重組載體，其特征在于，所述重組載體包括有如SEQ ID No:3所示的堿基序列。

2.權利要求1所述的羅非魚無乳鏈球菌Sip基因真核表達重組載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、將Sip基因與pMD^TMl8-T載體連接，轉化感受態細胞，得到重組子；

(2)、采用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切步驟(1)的重組子，得到包括有如SEQ ID No:3所示堿基序列的基因片段，再采用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切質粒pcDNA3.1(+)，連接所述基因片段和酶切后的質粒pcDNA3.1(+)，轉化感受態細胞，得到羅非魚無乳鏈球菌Sip基因真核表達重組載體。

3.根據權利要求2所述的羅非魚無乳鏈球菌Sip基因真核表達重組載體的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述Sip基因是以羅非魚無乳鏈球菌分離強毒株基因組DNA為模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2為引物進行PCR擴增得到的。

4.一種殼聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分包括權利要求1所述的羅非魚無乳鏈球菌Sip基因真核表達重組載體。

5.根據權利要求4所述的殼聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗還包括殼聚糖-PLGA包裹微球，所述殼聚糖-PLGA包裹微球是以1～4mg/mL的PLGA、0.3～0.9mg/mL的殼聚糖和0.5～2mg/mL PVA為原料制備而得。

6.根據權利要求5所述的殼聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述殼聚糖-PLGA包裹微球是以2mg/mL的PLGA、0.3mg/mL的殼聚糖和2mg/mL PVA為原料制備而得。

7.根據權利要求4所述的殼聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述羅非魚無乳鏈球菌Sip基因真核表達重組載體體積為600μL,濃度0.5～1.5mg/mL。

8.根據權利要求7所述的殼聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述羅非魚無乳鏈球菌Sip基因真核表達重組載體體積為600μL,濃度1mg/mL。

9.權利要求4-8任一項所述的殼聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、將600μL濃度0.5～1.5mg/mL的權利要求1所述的羅非魚無乳鏈球菌Sip基因真核表達重組載體滴入以二氯甲烷為溶劑的濃度為10mL濃度為1～4mg/mL的PLGA溶液中，充分攪拌混勻，制備成初乳；

(2)、將步驟(1)的初乳滴入150mL含有濃度為0.3～0.9mg/mL的殼聚糖的PVA水溶液中，徹底攪拌，形成水包油包水復乳液；所述PVA的濃度為0.5～2mg/mL；

(3)、磁力攪拌上述水包油包水復乳液，使得二氯甲烷揮發完全，離心，獲得殼聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗。

10.權利要求1所述的羅非魚無乳鏈球菌Sip基因真核表達重組載體，或權利要求4-8任一項所述的殼聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗在制備防治羅非魚無乳鏈球菌病的藥物中的應用。