[發明專利]一種帶生物膜的細菌微囊及其應用

在審

• 申請號: 201610412051.4
• 申請日: 2016-06-12
• 公開（公告）號: CN107488653A
• 公開（公告）日: 2017-12-19
• 發明（設計）人: 馬小軍;高夢;于煒婷;鄭會珍;任英
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/08;C12N11/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及一種微囊化細菌的新應用，具體地說是用于研究群體感應對生物膜的調控過程。

背景技術

細菌生物膜(bacterial biofilm)是細菌在生長過程中為適應生存環境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一種與浮游細胞相對應的生長方式，由細菌和自身分泌的胞外基質組成。這類細菌群體耐藥性極強，可以逃避宿主免疫作用，且感染部位難以徹底清除，是臨床上難治性感染的重要原因之一。細菌生物膜在自然界中很常見，輸水系統、食品加工、航運等領域都可見到細菌生物膜的影響。此外，細菌生物膜與多種人體相關性感染性疾病的關系也非常密切。當細菌以細菌生物膜形式存在時耐藥性明顯增強(10～1 000倍)，抗生素應用不能有效清除細菌生物膜，還可誘導耐藥性產生。目前生物膜引起的微生物耐藥明顯增加，約65％的人類感染與生物膜有關[Mukherjee PK,Mohamed S,Chandra J,et al.Alcohol dehydrogenase restricts the ability of the pathogen Candida albicans to form a biofilm on catheter surfaces through an ethanol-based mechanism.Infect Immun 2006,74(7):3804-3816.]，更有學者認為超過80％的人類感染中有生物膜的形成。

細菌的群體感應在生物膜形成過程中發揮著至關重要的作用。群體感應是一種微生物細胞間的溝通方式，該效應的產生依賴于信號分子的產生、分泌和檢測，而信號分子的濃度直接與相鄰環境內微生物數量相關。當信號分子的濃度達到某一閾值時，細胞群體會感受到信號分子并做出相應的響應，使群體的基因表達發生改變，產生少量菌體所不能產生的特殊效應，如分泌毒性因子，形成生物膜和產生生物發光現象[Bassler,B.L.；Losick,R.,Bacterially speaking.Cell 2006,125,(2),237-46.]。探究細菌群體感應對生物膜的調控機制，有助于了解生物膜形成本質，從而找到快速有效的方法，繞過細菌生物膜的耐藥性，從新的手段抑制或徹底消除病原菌生物膜。

然而，目前對細菌群體感應調控生物膜形成機制的研究，主要是在二維的懸浮培養條件，人為的構建附著在無機或有機物表面的細菌生物膜。這種生物膜結構，與人體內具有力學變化的三維環境存在較大差異，并且忽視了細菌與環境的相互作用過程。有機或無機的固體表面，力學性能單一明確，不存在與細菌的動態交互，距體內真實的組織環境相差較遠。

發明內容

針對上述問題，本發明提出微囊化細菌的新應用，用于研究群體感應對生物膜的調控過程。其優點是可以在多細胞水平調控細菌生物膜，模型內細胞經過生長繁殖，形成聚集體形態的生物膜結構，這種聚集體結構受細菌的群體感應調控，并能影響生物膜形成的厚度。同時，水凝膠微囊的力學特性與體內組織更為接近，并且三維的凝膠骨架結構在生物膜形成的過程中可以與細胞之間形成動態交互，更接近體內的真實環境。

技術方案

一種帶生物膜的細菌微囊，由包埋有細菌的海藻酸鹽-聚陽離子絡合微膠囊形成，并培養得到，微膠囊內菌體增殖后形成聚集體形態的生物膜結構。

本發明的技術方案是提供微囊化細菌用于研究細菌生物膜的應用，具體步驟為：

A：按10⁶-10⁸CFU/mL海藻酸鈉的初始接種量將微生物細胞混懸在海藻酸鈉溶液(0.1-50g/L)中，制備海藻酸鹽微球，稱之為A微球。其中，海藻酸鹽微球的制備方法包括靜電液滴法、銳孔擠出法、乳化-外部凝膠化法、乳化-內部凝膠化法或膜乳化法；

B：將上述水凝膠微球浸入聚陽離子溶液中，微球與聚陽離子溶液體積比為1:1～1:40，反應1-60分鐘，此時得到海藻酸鈉-聚陽離子微膠囊。取出用生理鹽水洗滌2-10次，稱之為B微球；

C：將第二步中的B微球浸入金屬螯合劑溶液中，液化微膠囊內部的海藻酸鹽凝膠。參與液化反應的有機金屬螯合劑溶液為40-70mmol/L的檸檬酸鈉或50-200mmol/L的EDTA。微膠囊與有機金屬螯合劑溶液體積比范圍為1:1～1:40，反應1-60分鐘，取出用生理鹽水洗滌，此時得到內部液態核心的微膠囊，稱之為C微球。