[發(fā)明專利]用于狗源性成分?jǐn)?shù)字PCR精準(zhǔn)定量檢測的引物探針、試劑盒及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610408968.7
• 申請日: 2016-06-12
• 公開（公告）號: CN107488708A
• 公開（公告）日: 2017-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃文勝;陳穎;任君安;吳亞君;葛毅強(qiáng);鄧婷婷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用于狗源性成分檢測的寡核苷酸引物和探針，用于測定狗源性成分的數(shù)字PCR檢測方法，用于精準(zhǔn)定量檢測狗源性成分的數(shù)字PCR檢測試劑盒以及狗源性成分的特異性寡核苷酸引物和探針在檢測樣品中狗源性成分中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

肉及其制品營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量約為10%-20%，畜肉中含豐富的B族維生素，禽肉中不飽和脂肪酸含量較高，如人體必需的亞油酸，約占總脂肪含量的20%。全國范圍內(nèi)肉制品的產(chǎn)量和消費(fèi)量持續(xù)升高，2013年我國成為全球肉類生產(chǎn)第一大國，年產(chǎn)量達(dá)8536萬噸，伴隨而來的是近年來肉制品的摻假摻雜事件頻繁發(fā)生。2013年，我國部分地區(qū)開展了肉及其制品的摻假情況調(diào)查，結(jié)果顯示有25.6%的樣品與標(biāo)識不符，肉制品摻假情況較明顯。在部分地區(qū)，食用狗肉的歷史源遠(yuǎn)流長，而在部分地方的檢驗(yàn)檢疫過程中，發(fā)現(xiàn)了用牛肉替代狗肉的情況，這類肉制品摻假事件嚴(yán)重干擾了我國的肉業(yè)生產(chǎn)，不僅成為制約肉品質(zhì)量提升的主要因素，而且嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利益和知情權(quán)，此外，對于信奉伊斯蘭教的民族，在清真食品中摻雜入狗肉或其他血漿成分等非清真食品，違反了其宗教信仰，造成了惡劣影響。

然而，目前基于肉類的檢測方法基本上都是定性和半定量檢測，國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)也只能進(jìn)行成分的定性檢測，無法進(jìn)行精準(zhǔn)定量檢測。雖然目前質(zhì)監(jiān)、食藥監(jiān)等部門下屬的很多實(shí)驗(yàn)室均具備一定的肉類DNA鑒定技術(shù)，但只能確定“摻假肉”中摻了哪些肉類，而不能判斷其摻雜肉的含量。因此很難判斷摻雜肉是故意添加還是無意污染，導(dǎo)致難以判定違法廠商的責(zé)任，使不少不法商販得以逃脫懲罰。

目前，肉類定性或半定量檢測常采用實(shí)時熒光PCR技術(shù)，這種技術(shù)可以通過Ct值與模板量建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以此初步確定模板中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。但是，利用實(shí)時熒光PCR技術(shù)對肉類成分定量檢測存在以下問題：（1）每次進(jìn)行檢測操作都需要同時進(jìn)行已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，提高了檢測成本且工作量過大；（2）標(biāo)準(zhǔn)品與實(shí)際樣品PCR擴(kuò)增效率的差別可能會引起定量結(jié)果產(chǎn)生偏差；（3）通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到了模板拷貝數(shù)的準(zhǔn)確度存在一定誤差。因此，本領(lǐng)域需要一種快速、特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高的狗源性成分的檢測方法和定量方法，進(jìn)行食品中狗源性成分的檢測。

數(shù)字PCR(digital polymerase chain reaction, dPCR)是在熒光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因絕對拷貝數(shù)定量技術(shù)，它可以實(shí)現(xiàn)單分子DNA的絕對定量，并且它具有測量獨(dú)立性，無需任何校準(zhǔn)物，解決了實(shí)時熒光PCR需要Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線確定拷貝數(shù)而產(chǎn)生的結(jié)果不準(zhǔn)確等問題。目前，該技術(shù)已初步應(yīng)用于肉類產(chǎn)品的定量檢測。隨著我國對肉類摻假檢驗(yàn)?zāi)芰π枨蟮娜找鎻?qiáng)烈，dPCR 技術(shù)的出現(xiàn)為肉類成分定量檢測開辟了新的途徑，使得食品中肉類成分的定量分析與溯源成為可能。利用dPCR技術(shù)提升定量檢測方法的準(zhǔn)確性與實(shí)用價值將成為肉類食品精準(zhǔn)定量檢測技術(shù)發(fā)展的一個重要方向。

因此，本領(lǐng)域需要一種快速、特異性好、靈敏度高的狗源性成分的檢測方法，能夠定量檢測狗肉湯、肉腸、肉卷、肉干等樣品中狗源性成分含量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的在于，提供精準(zhǔn)定量狗源性成分的特異性寡核苷酸引物和探針。

本發(fā)明的另一個目的在于，提供精準(zhǔn)定量狗源性成分的數(shù)字PCR檢測方法。

本發(fā)明的另一個目的在于，提供精準(zhǔn)定量狗源性成分的數(shù)字PCR檢測試劑盒。

本發(fā)明的還一個目的在于，提供狗源性成分的特異性寡核苷酸引物和探針在精準(zhǔn)定量檢測狗源性成分中的應(yīng)用。

針對上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：