[發(fā)明專利]一種產(chǎn)紅景天苷及其類似物的重組菌及構(gòu)建方法及用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610408741.2
• 申請日: 2016-06-03
• 公開（公告）號: CN107460203B
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙廣榮;李曉波;劉雪
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P19/44;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種產(chǎn)紅景天苷及其類似物的重組菌的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟：

(1)人工全合成酮基脫羧酶基因synkdc，所述酮基脫羧酶基因synkdc如SEQ ID No.03所示；人工全合成糖基轉(zhuǎn)移酶基因synyjic，所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因synyjic如SEQ ID No.04所示；

(2)將synkdc基因通過酶切，連接到表達載體pRSFDuet-1的第一個啟動子下游，篩選陽性克隆得到重組載體為pSynkdc1；

(3)將synyjic基因連接到pSynkdc1的第二個啟動子下游，篩選陽性克隆得到重組載體pSynkdc1-yjic；

(4)從大腸桿菌BL21(DE3)菌中克隆得到T7 RNA聚合酶基因，連接到載體pYSC1上，篩選陽性克隆得到重組載體為pYBH1，所述pYSC1載體序列如SEQ ID No.05所示；

(5)按下述三種方式之一種進行：

方式一：

①從大腸桿菌BL21(DE3)菌中克隆得到T7 RNA聚合酶基因，通過λRed同源重組技術(shù)整合到SyBE-002447底盤菌株染色體上得到SyBE-002447(DE3)菌株；

②將重組載體pSynkdc1-yjic轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SyBE-002447(DE3)中，得到SyBE-218011菌株；

方式二：

①將重組載體pYBH1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SyBE-002447中，得到SyBE-218012菌株；

②將重組載體pSynkdc1-yjic轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SyBE-218012中，得到SyBE-218013菌株；

方式三：

①將synkdc基因，通過λRed同源重組技術(shù)整合到大腸桿菌SyBE-002447(DE3)中，同時敲除基因feaB，得到SyBE-218014菌株；

②將synyjic基因，通過λRed同源重組技術(shù)整合到大腸桿菌SyBE-218014菌株中，同時敲除基因ushA，得到SyBE-218015菌株；

紅景天苷類似物為苯乙醇-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.權(quán)利要求1之一的方法構(gòu)建的產(chǎn)紅景天苷及其類似物的重組菌SyBE-218011菌株、SyBE-218013菌株或SyBE-218015菌株。

3.產(chǎn)紅景天苷及其類似物的重組菌制備紅景天苷及其類似物的方法，其特征是包括如下步驟：

將權(quán)利要求2的重組菌SyBE-218011、SyBE-218013或SyBE-218015接種在LB培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，震蕩培養(yǎng)2-4h，在OD₆₀₀到達0.8-1.0之間時，然后轉(zhuǎn)接到含有葡萄糖的M9培養(yǎng)基或紅景天苷植物原料酶水解的培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵，當葡萄糖濃度低于0.5g/L時，補加5g/L葡萄糖，持續(xù)合成紅景天苷及其類似物。