[發明專利]一種熱穩定性提高的脂肪酶TTL突變體TTL-Gly60Glu及其基因和應用

有效

• 申請號: 201610408342.6
• 申請日: 2016-06-10
• 公開（公告）號: CN107488647B
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發明（設計）人: 周銀華;劉丹妮;夏雨;王建榮;楊玲;李陽源;李天碧
• 申請（專利權）人: 廣東溢多利生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55
• 代理公司: 11318 北京法思騰知識產權代理有限公司
• 代理人: 高宇

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種熱穩定性提高的脂肪酶TTL突變體TTL?Gly60Glu及其基因和應用。所述脂肪酶TTL突變體TTL?Gly60Glu的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。突變體TTL?Gly60Glu在80℃水浴5min后剩余酶活為21.2％，提高至親本脂肪酶的1.16倍。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種熱穩定性提高的脂肪酶TTL突變體TTL-Gly60Glu及其基因和應用。

背景技術

脂肪酶(EC 3.1.1.3)全稱三酰基甘油酰水解酶，屬于α/β折疊酶家族，是一種絲氨酸水解酶。脂肪酶不僅可以在油水界面上催化天然底物油脂水解，釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸，而且在非水相體系中脂肪酶還可催化酸解、轉酯和酯合成等反應。工業飼料用脂肪酶主要來源于微生物，微生物分泌的脂肪酶具有較廣的作用pH值和作用溫度。隨著酶催化技術的不斷推廣，酶制劑的應用條件也越來越嚴格，如高溫、強酸強堿等特殊條件。脂肪酶作為一種重要的酶種被廣泛地應用到食品加工、飼料、洗滌、醫藥等領域。油脂加工和飼料制粒等工藝通常需在較高溫度下進行，熱穩定性差的脂肪酶在上述工藝中易失活變性，因此開發高熱穩定性脂肪酶一直是學術和產業界努力的目標。

為了得到更優的酶制劑，一方面可以從自然界篩選合適的酶基因，另一個途經就是將現有產業化的酶蛋白通過分子生物學技術進行改造，以適應不同產業的需求。現今改造酶蛋白的策略主要有兩個，其一是非理性設計，通過隨機突變改造酶的基因，再根據特定的改造目的，篩選出更符合其作用條件的酶蛋白。此策略優點是無須深入研究酶的結構和作用機理，但需要極大的工作量去完成篩選，效率偏低。

有文獻報道科學家從突尼斯南部火山地區分離得到一株嗜熱裸足菌，其分泌脂肪酶具有較好的耐熱性，70℃處理1h后剩余50％酶活。畢赤酵母培養條件簡單、易于工業化生產且高效分泌表達外源蛋白，已成功表達多個外源源脂肪酶。本發明利用畢赤酵母高效分泌表達嗜熱裸足菌來源的脂肪酶，并以嗜熱裸足菌脂肪酶基于為模板，通過定點突變技術獲得熱穩定性顯著提高的脂肪酶突變體。

發明內容

本發明的目的在于提供高熱穩定性的脂肪酶TTL。所述高熱穩定性脂肪酶TTL，是由親本脂肪酶TTL進行定點突變，獲得的脂肪酶突變體。用于表達所述脂肪酶的突變體的表達載體為pPICZαA和pPIC9K；用于所述表達載體轉化的宿主細胞是畢赤酵母X33和GS115。所述脂肪酶突變體為：Gly60Glu。

野生型的脂肪酶基因全長825個堿基(SEQ ID No.1)及其編碼的274個氨基酸(SEQID No.2)

SEQ ID NO.1