[發明專利]結直腸癌早期篩查試劑盒

在審

• 申請號: 201610407702.0
• 申請日: 2016-06-08
• 公開（公告）號: CN107475357A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 劉蘇燕;吳詩揚;董艷
• 申請（專利權）人: 益善生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司44224
• 代理人: 萬志香

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及一種結直腸癌早期篩查試劑盒。

背景技術

結直腸癌(colorectal cancer)是結腸或直腸內的細胞異常生長所形成的癌癥，為胃腸道中常見的惡性腫瘤，是世界第三高發惡性腫瘤，死亡率位居惡性腫瘤第四位，其早期癥狀不明顯，一般會經歷7～10年的從正常粘膜組織、腺瘤、再到惡性腫瘤的演變過程。結直腸癌近年在全球發病率直線上升，近些年來每年超過百萬人死于結直腸癌。結直腸癌多發生于中年以上的男性，男女兩性發病比例約為2:1，大多數患者年齡在40歲以上。早期結直腸癌缺少特異癥狀，當患者因臨床癥狀明顯而就診時往往已處于中晚期，大約25％的患者首診時就已出現轉移。目前，結直腸癌的根治性治療方法迄今仍首推外科治療，早期發現結直腸癌患者的五年存活率高達90％，一旦轉移，結直腸癌患者存活率不足10％。因此，治療的關鍵在于早期發現、及時診斷和手術根治。但是，目前結直腸癌早期診斷率不足40％，且據有關資料統計，結直腸癌的誤診率為30％，嚴重影響了治療的效果及預后。

研究已經確定了大量存在于結腸組織、糞便或血清中的生物標記物，如癌胚抗原(CEA)等，來用于結直腸癌的早期診斷和預測，但是目前大多數推薦的篩查方法的靈敏度和特異性都在50％以下。結直腸癌傳統的篩查方法包括糞便潛血試驗、糞便免疫試驗、結腸鋇劑灌腸檢查、乙狀結腸鏡檢查及結腸鏡檢查等，這些檢測方法都屬于腫瘤形成后診斷，且有可能誤診為痔、腸炎等，以致長期延誤治療。內窺鏡檢查是目前結直腸癌篩查的最好方法，但由于這種方法侵入性、費用高、風險大、易產生并發癥等缺陷限制了其在普查篩選中的應用。臨床研究早已證實，腫瘤團塊一旦形成，癌細胞通過不同途徑遷移到其它部位克隆生長。雖然也有針對結直腸癌相關腫瘤基因水平的早期篩查技術，如標志基因甲基化位點檢測、microRNA檢測等，但目前的檢測主要基于PCR反應原理，具有易污染、假陽性率高等缺陷。此外，缺乏特異性的早期診斷分子標志物也是限制結直腸癌早期診斷的重要因素。因此，急需一種針對結直腸癌早期診斷的分子標志物，以及特異性強、靈敏度高的檢測方法，能在基因的一級轉錄功能產物(mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷。

發明內容

本發明的目的在于提供一種特異性強、靈敏度高的結直腸癌早期篩查試劑盒。

實現上述目的的技術方案如下。

一種結直腸癌早期篩查試劑盒，包括針對檢測目標基因mRNA的捕獲探針以及信號放大系統；所述目標基因包括有結直腸癌篩查基因、非血源細胞相關基因，所述結直腸癌篩查基因選自CK20、ZEB1、CEA、CD24中的至少兩種；所述非血源細胞相關基因選自EGFR、CDX2、MACC1、LGR5中的至少兩種；所述信號放大系統包括有末端修飾有熒光基團的擴增探針，或包括有擴增探針和末端修飾有熒光基團的標記探針，不同種類目標基因的熒光基團互不相同；；其中，

所述捕獲探針用于連接目標基因mRNA與擴增探針，每條捕獲探針從5’端到3’端的堿基組成依次為：能與待檢測的目標基因mRNA結合的特異性序列P1、間隔臂序列、P2序列，所述P2序列為不存在發夾結構，探針內部和探針間不形成二聚體、不存在錯配，與P1、P4和目標基因mRNA之間均不存在特異性結合的序列，針對同一類別目標基因mRNA的捕獲探針的P2序列相同；

所述擴增探針連接捕獲探針與熒光基團，或連接捕獲探針與標記探針，每條擴增探針從5’端到3’端的堿基組成依次為：能與相應捕獲探針的P2序列互補配對的P3序列、間隔臂序列、P4序列；所述P4序列為不存在發夾結構，探針內部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在特異性結合的序列；

所述標記探針連接擴增探針與熒光基團，每條標記探針具有與相應擴增探針P4序列互補配對的P5序列，且末端修飾有熒光基團，不同種類目標基因的熒光基團互不相同。

在其中一個實施例中，所述目標基因還包括排除基因，所述排除基因選自CD45、CD34、CD105、CD146、VWF中至少兩種。