[發明專利]一種利用酵母菌表達含有穿膜肽的寡肽?1（EGF）創新制備工藝

在審

• 申請號: 201610389950.7
• 申請日: 2016-06-06
• 公開（公告）號: CN107459580A
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 易金陽
• 申請（專利權）人: 易金陽
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12P21/02;C07K1/18;C07K1/16;A61K38/18;A61K38/08;A61K8/64
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發明領域

本發明涉及一種工業化生產含有穿膜肽的寡肽-1(EGF)的制備方法，屬生物工程領域。

發明背景

穿膜肽是由小于30個氨基酸組成的具有細胞穿透功能的小肽，它能通過與細胞膜的相互交聯作用而穿過細胞膜這一天然屏障。最近通過設計獲得的ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)穿膜肽，能夠引導所承載的寡肽-1修復蛋白穿透細胞膜，經表皮滲透吸收，富含堿性氨基酸，含有較多的正電荷的肽片段，靶向導入皮膚基底層受體。該穿膜肽具有以下特性：

①具有凈正電荷性和兩親性；②穿膜轉運效率高；③可以導入近乎所有的細胞；④可以攜帶多種活性物質進入細胞；⑤可靶向穿透細胞膜，達到滅活多種病毒且不造成細胞損傷。

寡肽-1(EGF)是人體內的一種活性物質，由53個氨基組成的活細胞，藉由刺激寡肽-1受體之酪氨酸磷酸化，達到修補增生肌膚表層細胞，對創傷、潰瘍等受損之表皮肌膚擁有絕佳之療效。其最大特點是能夠促進細胞的增殖逆分化，從而以新生的細胞代替衰老和死亡的細胞。最初的寡肽-1主要被運用于醫學領域，以促進受損表皮的修復與再生，如治療燒傷、燙傷、潰瘍、促進傷口愈合、修復腸胃道、肝臟和眼角膜的損傷等，功效十分顯著。現代臨床早已將寡肽-1擴大應用于醫療耗材、人體保健及抗衰老的化妝品領域。

寡肽-1(即：重組人表皮生長因子)是美國生化學家Stanley Cohen博士于1962年最先在小鼠下頜腺的提取液中發現，并提出該因子有直接促進皮膚粘膜的修復和表皮細胞的生長，并能使衰老的細胞逆分化為年輕細胞，有促進膠原蛋白和彈力蛋白的合成，能促進肉芽組織再生，延緩細胞衰老、滋養女性生殖器官、淡化皺紋與色斑的作用，它是人類醫學與美學史上最偉大的發現之一。Stanley Cohen博士發現的EGF生長因子于1986年獲國際諾貝爾生理醫學獎。寡肽-1(EGF)全球市場需求量大，產品資源十分稀缺，為了解決全球市場對寡肽-1EGF敷料的需求供給，我公司聯合美國哈佛大學魏博士、山東農業大學于博士、中華生物醫藥研究院、廣東醫保藥業有限公司共同研究，創新了一種用酵母菌表達含穿膜肽的寡肽-1EGF制備方法，制得高純度融合新蛋白(PHPV蛋白)。用酵母菌表達含有穿膜肽與寡肽-1融合新蛋白(即PHPV蛋白)，PHPV蛋白不僅有穿膜肽與寡肽的獨立功能，而且其交聯融合后的新蛋白表面的負電荷(陰離子)C端與人乳頭瘤病毒HPV顆粒上的N端正電荷(陽離子)相互絡合，通過其表面所帶正電荷的N端與中間的疏水區及含有肽酶的識別區位點的C端負電荷相結合，將膜轉位信號與核定位信號的NLS偶聯，從而陰斷人乳頭瘤病毒侵入宿主細胞內，再通過細胞膜的相互作用而穿透細胞膜這一天然屏障，達到破壞病毒胞膜外殼治療HPV 感染的目的。

目前世界上尚未有含穿膜肽的寡肽-1融合蛋白在酵母菌中的基因工程工業化生產方法。

發明內容

本發明涉及穿膜肽和寡肽-1的融合蛋白，穿膜肽是通過設計獲得的ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)穿膜肽，(理論基礎＝WENDE PA，ROTHBARD J B，JESSOP T C，et al.Oligocarbamate molecular transporters：Design，synthes is，and biological evaluation of a new class of transporters for drug delivery JAme Chem Soc，2002，124(45)：13382-13383)富含堿性氨基酸，ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)穿膜肽位于寡肽-1(EGF)的C-端，優選緊鄰寡肽-1，也可以通過間隔序列與寡肽-1相連，含有較多的正電荷的肽片段，利用正負電荷非特異性相互作用的原理與細胞膜結合，打開皮膚細胞膜從而將目的蛋白靶向導入皮膚基底層受體。

本發明的目的是解決工業用基因工程酵母菌生產含穿膜肽的寡肽-1(EGF)的融合蛋白的方法。

一種工業化生產含穿膜肽寡肽-1(EGF)融合蛋白的制備方法，生產步驟如下：

(1)酵母菌擴培發酵：