[發明專利]一種屎腸球菌間接血凝檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201610382656.3
• 申請日: 2016-06-01
• 公開（公告）號: CN105866437B
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 劉永安;李學瑞;王立燕;馬麗娜;周建華;劉永生
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司11249
• 代理人: 呂玉博

技術領域

本發明屬于用于微生物的檢測試劑技術領域，具體涉及一種屎腸球菌間接血凝檢測試劑盒。

背景技術

屎腸球菌 ( Enterococcus Faecium)屬于革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性球菌, 是人和動物腸道內的主要菌群。自20世紀90年代以來，屎腸球菌已逐漸成為人和動物重要的條件性致病菌。目前，在動物研究方面，屎腸球菌感染主要依靠實驗室細菌分離、PCR分子生物學鑒定，在基層則缺乏快速有效的屎腸球菌血清學診斷方法。血清學診斷方法的缺乏，可能使得基層對屎腸球菌感染造成誤診及漏診，從而對畜牧業生產造成不必要的損失。

發明內容

本發明的目的是為了解決當前我國基層缺乏屎腸球菌抗體檢測技術難題，提供一種屎腸球菌間接血凝檢測試劑盒及其在檢測屎腸球菌中的應用。

本申請采用超聲細胞破碎法提取屎腸球菌菌體抗原作為檢測抗原，致敏醛化鞣酸化的綿羊紅細胞，與屎腸球菌高免兔血清，屎腸球菌陽性血清進行間接血凝實驗。結果顯示該方法特異性好、靈敏度高，可為屎腸球菌病的血清學快速診斷及流行病學調查提供依據。

本發明提供一種屎腸球菌間接血凝檢測試劑盒，所述試劑盒包括屎腸球菌間接血凝抗原，所述屎腸球菌間接血凝抗原由屎腸球菌CCTCC M 2016047的全菌蛋白和醛化-鞣酸化綿羊紅細胞組成。

作為優選，所述屎腸球菌全菌蛋白的濃度為100μg/ml-200μg/ml。

作為優選，所述屎腸球菌CCTCC M 2016047的全菌蛋白和醛化-鞣酸化綿羊紅細胞的體積為1:1。

作為優選，所述試劑盒還包括標準陽性血清。

作為優選，所述試劑盒還包括標準陰性血清。

作為優選，所述試劑盒還包括稀釋液。

作為優選，所述屎腸球菌間接血凝抗原的制備方法為：

（1）屎腸球菌菌體抗原的制備

對屎腸球菌進行擴大培養，離心收獲菌體后，洗滌，重懸，再于冰浴中以超聲波間歇破碎10min，離心取上清，得到屎腸球菌菌體抗原懸浮液；

（2）紅細胞的固定和醛化-鞣酸化

將保存于Alsever's 液中的公綿羊血在4℃靜置3-7天后，按常規方法對綿羊紅細胞進行洗滌、戊二醛固定和鞣酸處理，所用的溶液均為 pH 7.2濃度為0.15M的PBS，制備好的綿羊紅細胞用 pH7.2濃度為0.15M的PBS懸浮至5%濃度，得到醛化-鞣酸化后的紅細胞懸 液；

（3）屎腸球菌間接血凝抗原的制備

以步驟（1）得到的屎腸球菌菌體抗原致敏步驟（2）得到的紅細胞，得到屎腸球菌間接血凝抗原，屎腸球菌間接血凝抗原的終濃度為100μg/ml-200μg/ml。

本發明還提供上述試劑盒在檢測屎腸球菌中的應用，所述應用是非疾病的診斷和治療目的的應用。

作為優選，同時檢測n（n≤9）個待測血清的具體方法為：

（1）在滴定板1-n列每列第1孔分別加入待檢血清，第n+1、n+2、n+3分別加入同樣體積的標準陽性血清、標準陰性血清和空白對照，將1-n+2列從第1孔開始進行4倍倍比稀釋至最后一孔；

（2）每孔加入屎腸球菌間接血凝抗原；

（3）震蕩滴定板，充分混勻，置37℃恒溫箱1.5-2h；

（4）根據紅細胞凝集程度判定待檢血清效價，以出現50%紅細胞凝集的最大稀釋倍數作為該份血清的抗體效價。

本發明的優越性包括以下方面：（1）本發明中抗原為屎腸球菌菌體抗原，具有很強的特異性，能真實地檢測屎腸球菌抗體；（2）用蛋白致敏醛化-鞣酸化綿羊紅細胞，避免了新鮮綿羊紅細胞保存時間短、致敏效價低的缺點，易于長時間保存，血凝效價高。（3）操作簡單、方便快速，無需特殊設備和儀器，全程在2～3小時內完成，適合在基層推廣應用，可廣泛應用于屎腸球菌病流行病學的調查研究。（4）結果的重復性好，穩定，可靠，能夠準確的檢測屎腸球菌的抗體。（5）本發明是目前國內唯一的檢測屎腸球菌抗體的診斷試劑，且價格低廉，安全穩定，無毒性，無環境污染。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。

實施例1 屎腸球菌間接血凝診斷試劑盒的制備

屎腸球菌間接血凝診斷試劑盒的組分如下：

（1）屎腸球菌間接血凝抗原1瓶，10ml/瓶；