[發(fā)明專(zhuān)利]一種快速無(wú)創(chuàng)檢測(cè)EML4?ALK融合基因的方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610377728.5
• 申請(qǐng)日: 2016-05-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107446990A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王睿;崔芳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 凱斯金生物科技(北京)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京英創(chuàng)嘉友知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11447
• 代理人: 耿超,王浩然

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及一種用于快速無(wú)創(chuàng)檢測(cè)EML4-ALK融合基因的引物組、試劑盒、方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的首位。近50年來(lái)，世界各國(guó)特別是工業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家，肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明確，醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)表明肺癌的致病因素主要為吸煙，80％的男性肺癌和75％的女性肺癌是由吸煙造成的，此外與電離輻射、多環(huán)性芳香化合物、鎳、鉻、砷等工業(yè)致癌物的接觸，種族、家屬史對(duì)肺癌均有影響。

肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)，NSCLC包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌、大細(xì)胞癌、類(lèi)癌等，占肺癌的85％。NSCLC的治療包括手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療及生物免疫治療等多種方法。肺癌初次診斷時(shí)約70％已屬晚期，預(yù)后較差。晚期肺癌的主要治療方法是全身化療和靶向治療，以及局部放射治療。靶向治療以其符合生理、低毒和理論上高效的特點(diǎn)，已成為最受關(guān)注和最有前途的治療手段之一。與化療不同，靶向治療患者的腫瘤組織必須帶有某種特異的基因或者蛋白(統(tǒng)稱(chēng)為靶點(diǎn))，并且這種特異的靶點(diǎn)與肺癌的生長(zhǎng)關(guān)系密切。

ALK是一種間變性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)，2007年發(fā)現(xiàn)在肺癌患者中由于染色體倒位形成棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類(lèi)蛋白4(Echinoderm microtubule-associated protein-like 4,EML4)基因與ALK基因的融合(EML4-ALK)，使ALK酶組成型活化，促使肺癌發(fā)生和進(jìn)展。EML4-ALK融合基因可能存在于包括肺癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤中，但在NSCLC的檢出率最高，同時(shí)因其與EGFR突變、K-ras突變的不共存現(xiàn)象以及含有EML4-ALK融合基因患者的鮮明臨床特征，提示該靶點(diǎn)是肺腺癌特異性較高的分子標(biāo)記物。EML4-ALK融合基因(又叫ALK陽(yáng)性)的發(fā)現(xiàn)定義了NSCLC 的一個(gè)新亞型，堪稱(chēng)近年來(lái)NSCLC研究史上一個(gè)里程碑式的事件。目前，已至少發(fā)現(xiàn)了14種EML4-ALK的變異亞型。這些變異亞型均為EML4的不同外顯子與ALK的20外顯子相融合。亞型1(V1)，為EML4的第13外顯子與ALK的第20外顯子相連；亞型2(V2)，為EML4的第20外顯子與ALK的第20外顯子相連；亞型3(V3)，有兩個(gè)亞亞型(V3a/b)，V3a為EML4的第6外顯子與ALK的第20外顯子相連，而V3b為EML4的第6外顯子加上一個(gè)33bp的小片段再與ALK的第20外顯子相連；亞型4(V4)，為EML4的第14外顯子加上一個(gè)11bp的小片段再與前面缺失49bp的ALK的第20外顯子相連；亞型5(V5)，有兩個(gè)亞亞型(V5a/b)，V5a為EML4的第2外顯子與ALK的第20外顯子相連，而V3b為EML4的第2外顯子加上一個(gè)117bp的小片段再與ALK的第20外顯子相連；亞型6(V6)，為EML4的第13外顯子加上一個(gè)49bp的小片段再與ALK的第20外顯子相連；亞型7(V7)，為EML4的第14外顯子與前面缺失12bp的ALK的第20外顯子相連；亞型8(“V4”)，為EML4的第15外顯子缺失了后面19bp再與前面缺失20bp的ALK的第20外顯子相連；亞型9(“V5”)，為EML4的第18外顯子與ALK的第20外顯子相連。最常見(jiàn)的融合基因?yàn)閬喰?，其次為亞型3。所有這些融合基因均具有生物學(xué)功能，表達(dá)的產(chǎn)物為一種嵌合型絡(luò)氨酸激酶，可激活A(yù)LK基因的膜內(nèi)催化區(qū)域，激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活、遷移，達(dá)到細(xì)胞癌變的效果。

自融合基因發(fā)現(xiàn)以來(lái)，為尋找更簡(jiǎn)便和更準(zhǔn)確的方法，研究人員做了各方面大量的研究。目前用于A(yíng)LK融合基因的檢測(cè)方法主要有熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)等。