[發明專利]一種用于結核病血清學診斷的ELISA試劑盒

有效

• 申請號: 201610364298.3
• 申請日: 2016-05-30
• 公開（公告）號: CN106093420B
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 曾焱華;游曉攏;劉良專;李冉輝
• 申請（專利權）人: 南華大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70
• 代理公司: 武漢華旭知識產權事務所42214
• 代理人: 劉天鈺

技術領域

本發明涉及一種能夠用于結核病血清學診斷的ELISA檢測試劑盒，尤其涉及兩種能與結核病患者血清發生特異結合的結核分枝桿菌抗原，屬于生物工程和疾病診斷技術領域。

背景技術

結核病(Tuberculosis,TB)是由傳染性病原體結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的慢性傳染性人獸共患病，是威脅人類健康的最主要傳染性疾病之一。MTB主要分為人型、牛型、非洲型及鼠型，人類結核病90％以上由感染人型MTB引起，少數為牛型和非洲型所致。MTB可侵犯全身各器官系統，患病部位以肺臟最為常見，也可累及肝、骨和腦等其它器官。MTB感染分為潛伏性與活動性兩種狀態?；顒有苑谓Y核是指痰涂片陽性者：即體內有MTB排出，MTB繁殖活躍，毒力強。TB的傳染源主要是活動性的肺結核患者，其主要通過呼吸道傳播，也可用過破損的皮膚、粘膜和消化道等途徑傳染。MTB攜帶者感染HIV后，由潛伏期發展為活動性期的可能性遠高于未感染HIV者，病程發展更快。2014年世界衛生組織公布全球約960萬新發TB病例，110萬人死于TB，其中40萬為HIV陽性。

目前，TB的實驗室診斷方法主要有以下幾種：(1)細菌學診斷：痰涂片鏡檢法簡單、快速可靠，但其敏感性差；痰樣本培養是TB診斷的金標準，但傳統固體培養時間需60～90d，液體培養及藥敏試驗約需20d，且約40％的成人肺結核患者的痰涂片標本檢測為陰性。(2)血清學診斷：TB血清學診斷方法主要是利用免疫學技術檢測血清中特異性抗MTB的抗體。(3)結核菌素皮膚試驗：感染過MTB的機體產生相應的致敏淋巴細胞，再次注射PPD后，機體會在皮試試驗后的2～3d產生遲發型超敏反應，局部出現紅腫硬節。該試驗—直被應用于TB的臨床診斷，但其特異性差，常與環境分枝桿菌和卡介苗(BCG)產生交叉反應。(4)MTB核酸擴增檢測：該方法敏感性好，即使標本中拷貝數低的細菌也能被檢出，但臨床應用會有偏差，如標本處理不當，靶序列或擴增產物交叉污染等易造成假陰性。(5)IFN-γ釋放試驗：該方法是體外免疫學檢測的新方法，其商業化診斷試劑盒以EAST6和CFP10蛋白作為刺激抗原，一般釆用酶聯免疫吸附測定或者酶聯免疫斑點方法檢測機體全血或者外周血單核細胞中產生IFN-γ的T細胞數量及細胞因子變化量。

所有這些診斷方法中，血清學檢測是體外診斷TB的有效方法，其檢測方法簡單、快速、高效和低廉，成為近年來TB診斷的研究熱點。該方法通過基因工程獲取重組抗原，建立間接ELISA方法檢測病人血清中的抗MTB的抗體，在TB的血清學診斷中顯示出良好的應用價值，雖然目前已有基于重組抗原組合的商品化試劑盒如膠體金法試劑盒TB38-16KD，但在臨床檢驗中其特異性與敏感性不甚理想，且不能診斷潛伏性結核病。

因此，尋找特異性強和敏感性高的MTB抗原是提高TB血清學診斷陽性率的關鍵。

發明內容

本發明解決了背景技術中的不足，提供了一種用于TB血清學診斷的ELISA試劑盒，該試劑盒中的兩種重組蛋白(抗原)均能夠與TB患者血清發生特異結合，敏感性和特異性高，且能診斷潛伏性結核病，具有較好的應用前景。

實現本發明上述目的所采用的技術方案為：

一種用于TB血清學診斷的ELISA試劑盒，該試劑盒中至少包括包被液、洗滌液、封閉液和終止液，試劑盒中還包含以下組分：重組蛋白rRv2994，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；重組蛋白rRv3347c_6238-7278，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明成功構建了2種原核表達重組載體pET-28a/Rv2994和pET-28a/Rv3347c_6238-7278，將其分別轉化到E.coli BL21中并用IPTG誘導表達，分別表達出其相應的兩種重組融合蛋白，經鎳柱親和純化后獲得純化的重組蛋白。

所述包被液為0.05M的碳酸鹽緩沖液，其pH為9.6；所述的洗滌液為含0.05％Tween-20的PBST緩沖液，其pH為7.6；所述封閉液為含5％BSA的PBS緩沖液；所述的終止液為2mol/L的H₂SO₄溶液。

本發明所提供的重組蛋白rRv2994和rRv3347c_6238-7278均能與TB患者血清發生特異結合，經間接ELISA法檢測，兩種蛋白的敏感性和特異性分別為100.0％和96.5％、98.6％和94.7％，具有良好的免疫反應性，能夠作為TB血清學診斷的優選抗原。