[發明專利]一種生產紅景天苷的重組大腸桿菌及構建方法及應用

有效

• 申請號: 201610361309.2
• 申請日: 2016-05-26
• 公開（公告）號: CN107435049B
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發明（設計）人: 劉濤;畢慧萍;莊以彬;殷華;孫雪;馬延和
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P19/44;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

本發明公開了一種生產紅景天苷的重組大腸桿菌及構建方法及應用，構建方法為：(1)以大腸桿菌△A為出發菌株，通過基因敲除或基因沉默的方法使大腸桿菌△A染色體上的galE，galT和ugd基因不表達，得到大腸桿菌菌株BMGU；(2)向大腸桿菌菌株BMGU中導入ARO10，UGT73B6^MK，pgm，galU和T7Polymerase基因，使ARO10，UGT73B6^MK，pgm，galU和T7Polymerase基因過表達，異源合成紅景天苷，得到一種生產紅景天苷的重組大腸桿菌。本發明通過引入高效UDP葡萄糖基轉移酶突變體UGT73B6^MK，并對葡萄糖代謝途徑進行優化，顯著提高了紅景天苷的產量。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體地，涉及一種生產紅景天苷的重組大腸桿菌及構建方法及應用。

背景技術

紅景天是生長在高寒無污染地帶的珍稀野生植物，是我國藏族人民的習用藥物，至今已有1000多年的應用歷史，具有刺激神經系統、增加工作效率、消除疲勞和預防高山癥等作用。除此之外，紅景天還具有保護心腦血管，神經細胞以及抗腫瘤抗輻射等功能。紅景天的主要藥用活性成分是紅景天苷及其苷元酪醇。近年來，以紅景天苷作為主要原料生產的藥劑、飲料、食品以及化妝品等產品種類越來越多，其苷元酪醇是一種具有重要工業價值的酚類化合物，酪醇及其衍生物是多種有機化合物的合成前體。人們對紅景天苷及其苷元酪醇的關注程度不斷提高。除紅景天苷和酪醇外，紅景天植物中還含有其它一些化學物質，例如，淫羊藿次苷D2。

紅景天苷(Salidroside)具有以下特征：化學名稱為2‐(4‐hydroxyphenyl)ethyl‐β‐D‐glucopyranoside，分子式為C14H20O7，分子量為300.304，CAS號為10338‐51‐9，結構式為淫羊藿次苷D2(Icariside D2)具有以下特征：化學名稱為p‐(2‐hydroxyethyl)‐phenol‐D‐pyranoglucoside，分子式為C14H20O7，分子量為300.31，CAS號為38954‐02‐8，結構式為其苷元酪醇(Tyrosol)具有以下特征：化學名稱為4‐(2‐Hydroxyethyl)phenol，分子式為C8H10O2，分子量為138.164，CAS號為501‐94‐0，結構式為

目前，紅景天苷的生產主要是對紅景天植株進行化學提取。野生紅景天生長條件惡劣，植被資源稀有，而且紅景天苷的量很低，如現在最常用的高山紅景天和大花紅景天，其植株中紅景天苷的量只有0.5％‐0.8％。人工栽培的紅景天成本高而有效成分量低，達不到市場要求的標準。因而植物提取正面臨嚴峻的現實。除植物提取外，化學合成、微生物轉化及組織培養生產紅景天苷也是研究熱點。

明海泉以酪醇和溴代四乙酰葡萄糖為原料，以Ag₂CO₃為催化劑，成功合成了紅景天苷(明海泉，紅景天苷合成及藥理作用，藥學通訊，1986,21(6):373)。

王夢亮等以D‐葡萄糖和酪醇為底物，探索出了一種借助于微生物合成紅景天苷的方法(王夢亮，張芳，劉滇生，微生物催化D‐葡萄糖與酪醇葡糖基轉移合成紅景天苷的初步研究，催化學報，2006,27(3):233‐236)。

在采用組織培養方式進行紅景天苷的生物合成方面，研究成果最為成熟的是Wu等用致密愈傷組織體系進行的紅景天苷高產出率培養條件的研究。從高山紅景天的根、莖、葉、子葉等分離體得到的相應的幾種愈傷組織，并對其生長速度、紅景天苷量和培養繁殖條件進行篩選，確定了生成高產出率紅景天苷的最佳條件，紅景天苷最高收獲率可達到干重57.72mg/g，為野生植株的5～10倍(Wu S,Zu Y,Wu M High yield production ofsalidroside in the suspension culture of Rhodiola sachalinensis[J]JBiotechnol,2003,106(1):331)。