[發(fā)明專(zhuān)利]突變基因的定量檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610353070.4
• 申請(qǐng)日: 2016-05-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107435061B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃新華;戴慧清
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 金弗康生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6869
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 上海市匯業(yè)律師事務(wù)所 31325
• 代理人: 陸紅杰

本發(fā)明公開(kāi)了一種突變基因的定量檢測(cè)方法，步驟包括：1)提取樣本DNA；2)單鏈合成反應(yīng)；3)微球捕獲純化；4)微球上的3’端保護(hù)性外切純化反應(yīng)；5)以步驟4)的產(chǎn)物為模板進(jìn)行微球上的單鏈合成反應(yīng)，分離去除微球；6)3’端保護(hù)性外切純化反應(yīng)；7)雙端接頭橋媒連接反應(yīng)，并純化；8)以前次純化產(chǎn)物為模板，反復(fù)進(jìn)行單鏈合成反應(yīng)和3’端保護(hù)性外切純化反應(yīng)；9)定量，測(cè)序，判斷突變基因。該方法以靶標(biāo)基因片段為模板進(jìn)行反復(fù)多循環(huán)單鏈合成反應(yīng)，將原始模板上系列位點(diǎn)的堿基轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)序列，使靶標(biāo)基因序列最大保真地轉(zhuǎn)化合成，經(jīng)多級(jí)單鏈合成后，獲得測(cè)序所需的足量完整待測(cè)序列，如此提高了低比例突變基因的檢測(cè)靈敏度和保真度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA深度測(cè)序檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及組織、血漿或血清中10％～0.05％低比例的靶序列變異位點(diǎn)不確定的DNA片段的高保真深度測(cè)序檢測(cè)。

背景技術(shù)

基因科學(xué)是生命科學(xué)的一個(gè)重要領(lǐng)域，生命體的基因密碼序列及其變異會(huì)影響生命體的多種生物功能，導(dǎo)致功能變異，通過(guò)檢測(cè)生命體的基因變異可以了解和預(yù)估生命的功能變異，通過(guò)定量檢測(cè)生命體的基因變異情況，也可以精確了解患病生命體的疾病進(jìn)展和預(yù)后，例如腫瘤的進(jìn)展、復(fù)發(fā)的有無(wú)或早中晚期和治療效果。當(dāng)前，檢測(cè)基因變異已成為分析判斷遺傳疾病，腫瘤情況，個(gè)體化藥物反應(yīng)特征的重要手段，用于預(yù)測(cè)和預(yù)防出生缺陷，定期監(jiān)控腫瘤復(fù)發(fā)，監(jiān)控腫瘤個(gè)體化用藥和化療的治療效果。

目前，基因變異的檢測(cè)方法主要有一代測(cè)序法、二代測(cè)序法和三代測(cè)序法。一代測(cè)序，只能檢測(cè)變異在20％以上比例的樣品，低于20％，檢測(cè)的可靠性明顯降低，所以不能檢測(cè)稀有的低比例(1％---0.05％)基因變異型。當(dāng)前二代測(cè)序法(包括基因建庫(kù)和上機(jī)測(cè)序兩大環(huán)節(jié))的高深度測(cè)序(大于5000乘)可以檢測(cè)基因變異型比例低于10％的樣品。因?yàn)楫?dāng)前的測(cè)序建庫(kù)方法主要有兩種，一種是全基因測(cè)序建庫(kù)，將片段化的DNA樣品，進(jìn)行非特異接頭連接而建庫(kù)，建庫(kù)連接效率低于30％；又加純化的丟失，造成80％的原始模板序列信息丟失，對(duì)10000個(gè)基因組拷貝的DNA樣品中5個(gè)突變可能因丟失陽(yáng)性而致假陰性。因此，不可能準(zhǔn)確檢測(cè)到5/10000的突變。因?yàn)橐话愠檠?-10ml，得到血漿4-5ml以下，抽提到的DNA在

30—40ng，按3.3pg為一個(gè)基因組拷貝，30—40ng，約有10000-12000個(gè)拷貝。經(jīng)過(guò)建庫(kù)的丟失，只能剩2000-3000個(gè)拷貝，實(shí)現(xiàn)真正的10000乘高深度測(cè)序很困難。而且，即使1000乘深度的測(cè)序，全基因測(cè)序的費(fèi)用也高的驚人，無(wú)法普及應(yīng)用。

深度測(cè)序，適合用于靶基因靶區(qū)測(cè)序，雖然深度很深，但測(cè)序靶序列有限，費(fèi)用不高，可以普及應(yīng)用，解決腫瘤外周血突變基因檢測(cè)(又稱(chēng)CT-DNA檢測(cè))。靶基因靶區(qū)測(cè)序，當(dāng)前的方法有特異捕獲法和PCR擴(kuò)增法。特異捕獲法應(yīng)用特異序列探針雜交捕獲靶基因靶區(qū)片段，首先進(jìn)行接頭連接(效率約30％)，而后進(jìn)行連接產(chǎn)物純化，再進(jìn)行接頭擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行探針雜交捕獲。再進(jìn)行鋪獲產(chǎn)物擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)連接、捕獲，歸于原始模板的實(shí)際得率約20％。這樣10000個(gè)原始拷貝，約得到2000個(gè)源自初始模板的DNA分子，雖然通過(guò)PCR擴(kuò)增能達(dá)到足夠的序列，進(jìn)行5000乘，10000乘測(cè)序，但歸結(jié)于原始模板的序列數(shù)沒(méi)有提高，雖然深度很深，不能代表10000個(gè)原始模板的深度。30多個(gè)循環(huán)的PCR必將產(chǎn)生高比例的錯(cuò)配 誤差，嚴(yán)重影響測(cè)序的保真性和靈敏性。

當(dāng)前方法中，還有采用靶向特異擴(kuò)增方法獲得靶序列，一般特異擴(kuò)增10-20個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行接頭再擴(kuò)增，10-15個(gè)循環(huán)，總擴(kuò)增20—35個(gè)循環(huán)。這同樣帶來(lái)較嚴(yán)重的PCR錯(cuò)配誤差問(wèn)題，降低了檢測(cè)的信噪比。因?yàn)榛驍U(kuò)增的反應(yīng)中避免不了堿基錯(cuò)配延伸導(dǎo)致突變假陽(yáng)誤差，高保真聚合酶的錯(cuò)配延伸小于普通聚合酶，但，仍不可避免。如此擴(kuò)增，帶來(lái)了誤差性突變達(dá)0.5％--2％；這就嚴(yán)重影響了深度測(cè)序的保真性，也就影響了深度測(cè)序在CT-DNA檢測(cè)上的應(yīng)用。ct-DNA測(cè)序檢測(cè)的精度如能達(dá)到1/1000突變的檢出能力，才有較高的價(jià)值。