[發(fā)明專利]一種巨噬細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

在審

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• 申請日: 2016-05-20
• 公開（公告）號: CN105779392A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設計）人: 葛嘯虎;陳海佳;王一飛;萬樺
• 申請（專利權）人: 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786
• 代理公司: 北京市盈科律師事務所 11344
• 代理人: 劉雪花

技術領域

本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)領域，尤其涉及一種巨噬細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

背景技術

巨噬細胞是三大抗原提呈細胞之一，是參與非特異和特異性免疫的重要細 胞。它們的主要功能是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片及病原體進行 噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫細胞，令其對病原體作 出反應。由于巨噬細胞具有較強的吞噬功能以及抗原提呈功能，所以在免疫學 上具有較大的研究價值。

由于培養(yǎng)條件的限制，要獲得大量的巨噬細胞非常困難，更是缺少大規(guī)模 培養(yǎng)巨噬細胞的方法，限制了巨噬細胞的應用。現(xiàn)有技術中培養(yǎng)巨噬細胞的方 法如下：分離外周血中的單個核細胞(PBMC)，將PBMC使用含有30ng/mL GM-CSF(粒細胞和巨噬細胞集落刺激因子)、10％FBS(胎牛血清)的RPMI1640 培養(yǎng)基在37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用的培養(yǎng)器皿為T25、T75或者T175 的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)7天后收獲貼壁細胞，即為巨噬細胞。該現(xiàn)有技術方案對巨噬 細胞培養(yǎng)擴增有限，并且是針對小規(guī)模培養(yǎng)的方法，不適合大規(guī)模培養(yǎng)的需求， 在細胞需求量增大時，操作繁瑣，耗費大量人力和時間。

發(fā)明內容

有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種巨噬細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種巨噬細胞培養(yǎng)基，含有DMEM培養(yǎng)基、FBS、GM-CSF、脂多糖和白 介素-14(IL-14)。

優(yōu)選地，所述巨噬細胞培養(yǎng)基含有下述含量的下述組分：

進一步優(yōu)選地，所述巨噬細胞培養(yǎng)基含有下述含量的下述組分：

進一步優(yōu)選地，所述巨噬細胞培養(yǎng)基含有下述含量的下述組分：

一種巨噬細胞的培養(yǎng)方法，使用本發(fā)明巨噬細胞培養(yǎng)基、微載體和搖袋式 細胞培養(yǎng)生物反應器培養(yǎng)巨噬細胞。

優(yōu)選地，所述巨噬細胞的培養(yǎng)方法，包含以下步驟：

S1、用本發(fā)明巨噬細胞培養(yǎng)基重懸PBMC，使PBMC密度為0.5×10⁶-2× 10⁶cells/mL，再將其接種于培養(yǎng)瓶，每3-4天換液一次；培養(yǎng)7天后棄去上清， 加入胰酶-EDTA消化液消化至細胞完全脫落，加入3倍體積的FBS終止消化， 離心去除上清液；

S2、用本發(fā)明巨噬細胞培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度至5×10⁴cells/mL， 取4×10⁷個細胞與4g微載體混合，將混合液加入搖袋式細胞培養(yǎng)生物反應器中 在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)；20轉/分鐘培養(yǎng)3小時，50轉/分鐘培養(yǎng)至第3天， 70轉/分鐘培養(yǎng)至第6天，每3天向反應器中添加100mL培養(yǎng)基；

S3、倒出反應器中的培養(yǎng)基，離心去除上清，PBS清洗2遍后用胰酶-EDTA 消化液消化5分鐘，加入3倍體積的FBS終止消化，離心去除上清，用PBS重 懸沉淀，過濾收集濾液即得巨噬細胞。

優(yōu)選地，所述搖袋式細胞培養(yǎng)生物反應器為25型GEwave搖袋式細胞培養(yǎng) 生物反應器。

優(yōu)選地，所述微載體為Cytodex-1微球載體。

優(yōu)選地，所述微載體在使用前進行預處理，預處理的方法為將Cytodex-1微 球載體用DMEM培養(yǎng)基浸泡過夜。

優(yōu)選地，所述胰酶-EDTA消化液中EDTA的質量濃度百分數(shù)為0.02％，胰 酶的質量濃度百分數(shù)為0.25％。

現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)方法是使用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每個培養(yǎng)瓶培養(yǎng)出來的最大細胞 數(shù)為1×10⁷個，因此如果要獲得1×10⁹個細胞，需要大量人力物力和時間，且 巨噬細胞難被從培養(yǎng)瓶上消化下來，操作時間長，操作時污染風險大。與現(xiàn)有 技術相比，本發(fā)明是一種大規(guī)模培養(yǎng)巨噬細胞的方法，可以獲得10⁹個以上細胞。 本發(fā)明操作簡便，只需要操作一臺儀器和一個培養(yǎng)袋，單人就可以操作，可有 效的縮短培養(yǎng)時間和操作時間，減少人力物力的浪費。

具體實施方式

為了更好的說明本發(fā)明，下面結合具體實施方式做進一步說明。本發(fā)明中 所用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領域所熟知的，在 此不再贅述。