[發明專利]一種里氏木霉重組t-PA的分離純化方法

有效

• 申請號: 201610343132.3
• 申請日: 2016-05-23
• 公開（公告）號: CN105754976B
• 公開（公告）日: 2020-01-03
• 發明（設計）人: 邵金華
• 申請（專利權）人: 湖南科技學院
• 主分類號: C12N9/58
• 分類號: C12N9/58;C12R1/885
• 代理公司: 11371 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 李進

1.一種里氏木霉重組t-PA的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

將里氏木霉發酵制得的含有t-PA的粗酶液預處理后得到澄清液；

所述澄清液采用D296強陰離子交換樹脂柱進行脫色，脫色后用磷酸緩沖液洗脫，得到洗脫液；所述D296強陰離子交換樹脂柱的直徑為1.5±0.2cm，長度為30±1cm；所述澄清液在D296強陰離子交換樹脂柱中的線速度小于 0.5cm/min；

所述洗脫液采用硫酸銨進行鹽析，鹽析時，硫酸銨的添加量為：用硫酸銨調節所述洗脫液至飽和度為40%-50%；鹽析后，在2-6℃，以7000-8000r/min 離心20-30min，得到沉淀；

將所述沉淀用磷酸緩沖液溶解，所述沉淀與所述磷酸緩沖液的質量比為1:4-6；然后進行透析脫鹽；

脫鹽后的酶液采用Q-Sepharose High Performance強離子交換色譜進行分離純化，用磷酸緩沖液配置成的0-1mol/L的氯化鈉進行梯度洗脫收集得到活性組分液；所述Q-Sepharose High Performance強離子交換色譜中的柱子的直徑為2.6±0.2cm，長度為7±1cm；流速為1.8-2.2 mL/min；

所述活性組分液經冷凍抽干即得t-PA成品；

所述鹽析的溫度為2-6℃，時間為7-9h；

所述透析脫鹽采用透析袋進行，所述透析袋截留分子量為10000 Da；

上述步驟中使用的磷酸鹽緩沖液的濃度均為0.018-0.022 mol/L，pH均為7.3-7.5。

2.根據權利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，鹽析時，硫酸銨的添加量為：用硫酸銨調節所述洗脫液至飽和度為45%。

3.根據權利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述透析袋在使用前，先在0.9-1.1mol/L EDTA溶液中煮沸8-15min，再在質量濃度為1.9%-2.1%的NaHCO₃溶液中煮沸8-12min，最后在蒸餾水中煮沸8-15min。