[發明專利]一種3?氨基?2?惡唑烷酮免疫檢測方法

有效

• 申請號: 201610339702.1
• 申請日: 2016-05-20
• 公開（公告）號: CN105911272B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 王保民;張威;陳俊玉;王冕;謝紫君;楊濤;寧香雪;郭素琴;譚桂玉;丹陽
• 申請（專利權）人: 福建安欣睿捷生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司35211
• 代理人: 戴雨君

技術領域

本發明涉及含有呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的檢測方法及其應用。

背景技術

呋喃唑酮(痢特靈)是一種硝基呋喃類抗生素，為廣譜抗菌藥。3-氨基-2-惡唑烷酮(3-Amino-2-oxazolidinon,AOZ)是呋喃唑酮在動物體內的代謝物。呋喃唑酮可用于治療細菌和原蟲引起的痢疾、腸炎、胃潰瘍等胃腸道疾患。對常見的革蘭氏陰性菌和陽性菌有抑制作用。對毛滴蟲、賈第鞭毛蟲也有一定的活性。其作用機制為干擾細菌氧化還原酶從而阻斷細菌的正常代謝。

人口服呋喃唑酮吸收率低，通過血液循環主要停留在腸道內。但該藥物對肝、腎刺激大、易充血及發生體內糖代謝及神經病變作用，并可在體內殘留。過量使用呋喃唑酮可能會導致胃腸道反應；溶血性貧血、皮疹、藥熱等過敏反應；多發性神經炎；新生兒和G-6-PH缺乏可致溶血性貧血。實驗證明，硝基呋喃類藥物及其代謝產物具有致癌和致突變的特性。

由于呋喃唑酮的毒副作用，各國政府都采取了相關管制政策。美國在1975年和1993年分別禁止了呋喃唑酮作為醫藥和獸藥使用。日本在1977年禁止了呋喃唑酮的使用。2002年，中華人民共和國農業部將呋喃唑酮列為禁止使用的藥物，不得在動物性食品中檢出。中華人民共和國食品藥品監督總局也于2002年禁止了硝基呋喃類(包括呋喃唑酮)在動物性食品中的使用。

但是，硝基呋喃類藥物藥效顯著、價格低廉，能在動物體內迅速代謝從而難以檢測。我國的養殖業中，仍有一些不法分子在利益的驅使下濫用了呋喃唑酮藥物，對消費者的健康帶來了極大的隱患，同時也嚴重損害了農產品進出口貿易。因此市場上急需一種高效快速靈敏的呋喃唑酮藥物殘留的檢測方法。

由于酶聯免疫吸附檢測(ELISA)是一種具有突出優勢的檢測方法。該方法具有快速、簡單、準確、高通量、無需專業操作等優點，使得它成為一種理想的市場監查檢測方法。國家標準(GB/T 20752-2006，豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定)等的文獻報道，把AOZ提取出來，在提取后用鄰硝基苯甲醛作為衍生劑，與AOZ發生成肟反應從而生成NP-AOZ，但是NP-AOZ的酶聯免疫吸附檢測不夠靈敏。

本發明創新地運用了一種呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的檢測方法，使得相應的ELISA檢測靈敏度大幅度提高。因此，本發明建立的酶聯免疫吸附檢測方法可以大大提高檢測準確性，為各層監督單位提供快速、高效、準確的檢測方法，具有不可估量的市場價值。

發明內容

為了使得用于檢測如動物源性食品及其加工產品等樣品中AOZ殘留的icELISA具有更高的靈敏度，本發明創新了一種3-氨基-2-惡唑烷酮的處理方法，使得icELISA更加高效更適宜于實際樣品的檢測。

本發明所述的3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法如下，將待測樣品中的3-氨基-2-惡唑烷酮通過肟反應衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮后進行酶聯免疫吸附檢測，以測定待測樣品中的3-氨基-2-惡唑烷酮含量。

本發明中用3-醛基苯甲酸甲酯與待測樣品中的3-氨基-2-惡唑烷酮發生肟反應。

本發明所述的酶聯免疫吸附檢測為間接競爭酶聯免疫吸附(icELISA)測定。

本發明的待測樣品的獲取方法為將待檢物與甲醇-水混合溶液混合研勻，離心后的沉淀物為待測樣品。

本發明的待測樣品肟反應的操作方法步驟包括：1)將沉淀物與鹽酸溶液混合研勻；2)再與3-醛基苯甲酸甲酯混勻后旋干；3)再加入1,4-二氧六環在氮氣保護條件下加熱回流，減壓旋轉蒸發得到固體粉末；4)向步驟(3)的固體粉末中加入乙醇溶解；5)抽濾獲取白色固體為含有衍生得到的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮的物質。

本發明所述的酶聯免疫吸附檢測中用完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-BSA免疫動物體獲得抗血清。所述的酶聯免疫吸附檢測為基于上述抗血清的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮間接競爭酶聯免疫吸附反應。

本發明所述的酶聯免疫吸附檢測中以完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-OVA作為固相抗原。

本發明所述的酶聯免疫吸附檢測中以3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮為競爭性抑制物，以抗血清為一抗，以IgG-HRP為酶標二抗。

本發明所述的3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法的應用，尤其在于將待測樣品中的3-氨基-2-惡唑烷酮通過肟反應衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮后進行酶聯免疫吸附檢測在3-氨基-2-惡唑烷酮快速檢測試劑盒方面的應用。