[發(fā)明專利]腫瘤細(xì)胞免疫治療用的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610339159.5
• 申請(qǐng)日: 2016-05-21
• 公開（公告）號(hào): CN105779391A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫芙蓉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 孫芙蓉
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 長沙星耀專利事務(wù)所 43205
• 代理人: 許伯嚴(yán)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫領(lǐng)域，具體涉及一種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì) 胞以及制備該高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

免疫治療作為腫瘤綜合治療的第四種模式，越來越受到重視。腫瘤免疫治療主要包括腫 瘤疫苗治療、細(xì)胞因子治療、過繼性細(xì)胞免疫治療及單克隆抗體免疫治療等。腫瘤疫苗是利 用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗癌能 力，阻止腫瘤的生長、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)。用于抗腫瘤研究的細(xì)胞因子主要有干擾素類、白細(xì)胞介 素類、集落刺激因子類等，其中以IFN-α、IL-2、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子為多。過繼性細(xì) 胞免疫包括淋巴細(xì)胞因子活化的殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞、DC-CIK等。 單克隆抗體免疫療法的現(xiàn)有研究結(jié)果表明，腫瘤分子靶向治療具有較好的安全性和有效性， 如小分子表皮生長因子受體(EGFR)、酪氨酸激酶抑制劑、抗EGFR單克隆抗體、抗血管內(nèi) 皮生長因子單克隆抗體以及其他分子靶向治療藥物，已在臨床中取得較好的療效。

目前用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的免疫活性細(xì)胞主要有腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TIL)、樹突狀 細(xì)胞(DC)以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)等。CIK細(xì)胞是一種殺傷力強(qiáng)的免疫活性 細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞的表面標(biāo)志為CD3⁺CD56⁺，與其他過繼性免疫治療細(xì)胞相比，具有增 殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣等優(yōu)點(diǎn)。但是，腫瘤病人免疫功能受損，免疫細(xì)胞功能減 弱，因此，來源于腫瘤病人外周血制備的CIK細(xì)胞殺傷腫瘤能力低下，影響CIK細(xì)胞療效。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞以及制備該 高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞的方法，該CIK細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖力，CD3⁺、CD8⁺和CD3⁺CD56⁺細(xì)胞的比例高，并且對(duì)腫瘤治療效果優(yōu)異。

上述目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞，通過如下步驟制備：(1)取患 者外周血，收集外周血的單個(gè)核細(xì)胞部分；(2)將步驟(1)收集的外周血的單個(gè)核細(xì)胞部 分離心，棄去上清液，獲得單個(gè)核細(xì)胞；(3)取單個(gè)核細(xì)胞按照1×106/mL細(xì)胞，加入含 500～2000IU/mLγ干擾素和80～120ng/mL如下結(jié)構(gòu)所示化合物(Ⅰ)的完全培養(yǎng)基，開始 誘導(dǎo)培養(yǎng)；其中，完全培養(yǎng)基，包括含體積百分比為10％FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液；(4) 步驟(3)的細(xì)胞培養(yǎng)20～28小時(shí)后，加入50～1000ng/mL抗人CD3單克隆抗體和 500～2000IU/mL重組人IL-2，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，每隔2～3天傳代培養(yǎng)一次，整個(gè)誘導(dǎo)培 養(yǎng)的時(shí)間為13～21天，獲得高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞；化合物(Ⅰ)結(jié)構(gòu)為：

進(jìn)一步地，步驟(1)所述收集外周血的單個(gè)核細(xì)胞部分的方法為：(a)患者外周血中， 加入1～1.5倍體積的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液或pH7.2PBS緩沖液稀釋，充分混勻；其中，細(xì) 胞培養(yǎng)液包括：RPMI1640培養(yǎng)液和IMDM培養(yǎng)液；(b)將步驟(a)獲得的血液稀釋液加 入到淋巴細(xì)胞分離液的界面上；(c)1500～2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心15～20分鐘，收集中間層，獲 得單個(gè)核細(xì)胞。

進(jìn)一步地，步驟(1)中所述收集外周血的單個(gè)核細(xì)胞部分的方法為：患者經(jīng)采用血細(xì)胞 分離機(jī)上的淋巴細(xì)胞采集程序，單采集患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，離心的轉(zhuǎn)速為1000～1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時(shí)間為7～10分鐘。

進(jìn)一步地，步驟(4)所述繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2～3天用含500～2000IU/mL重組人IL-2的 完全培養(yǎng)基或含500～2000IU/mL重組人IL-2和100～500IU/mL重組人IL-1的完全培養(yǎng)基傳代 培養(yǎng)。

上述化合物(Ⅰ)在制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞中的應(yīng)用。

上述用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

有益效果：