[發明專利]一種體外擴增NK細胞的方法及其獲得的NK細胞在審
| 申請號： | 201610331306.4 | 申請日： | 2016-05-18 |
| 公開（公告）號： | CN105754942A | 公開（公告）日： | 2016-07-13 |
| 發明（設計）人： | 魯振宇;韓洪起;劉俊江;張冰晶;秦臻;徐悅;黃文敬 | 申請（專利權）人： | 天津普瑞賽爾生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/0783 | 分類號： | C12N5/0783 |
| 代理公司： | 天津才智專利商標代理有限公司 12108 | 代理人： | 王曉紅 |
| 地址： | 300392 天津市南開區濱海高新區*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 體外 擴增 nk 細胞 方法 及其 獲得 | ||
技術領域
本發明涉及一種體外擴增NK細胞的方法，尤其是以外周血單個核細胞(PBMC)作為種子細胞，通過在誘導培養開始及每次擴大培養時，將細胞加入到預先包被CD16Mab的培養瓶中，對細胞進行連續刺激并最終制備大量高純度NK細胞的方法及其獲得的NK細胞。
背景技術
腫瘤是目前困擾人類的最為重大的疾病，無論發病率和死亡均高居第一。腫瘤的免疫療法作為腫瘤治療的第四種手段正逐漸被人們所接受，NK細胞作為腫瘤免疫治療技術中一個非常重要的組成部分，因其細胞毒性強、起效迅速且無抗原抑制性等優點而得到廣泛的重視。并且，除了腫瘤細胞殺傷的功能外，NK細胞還具有抗病毒感染這一特有屬性。目前，困擾NK細胞大規模應用的最大問題是其體外擴增困難，且制備成本較高。而以腫瘤滋養層促進NK細胞擴增的方法雖然能夠獲得大量的高純度的的細胞，但是安全性問題卻是其無法繞過的門檻。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是，提供一種體外擴增NK細胞的方法及其獲得的NK細胞，以外周血中分離獲得的單個核細胞作為種子細胞，通過以CD16Mab包被培養瓶進行連續刺激的方法最終制備大量高純度NK細胞的方法以及獲得的NK細胞。
為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種體外擴增NK細胞的方法，包括以下步驟：
1)以外周血中分離獲得的單個核細胞PBMC作為種子細胞；
2)配制NK細胞完全培養基：含有體積分數5-8％的FBS，以及終濃度500-1000IU/ml的IL-2、終濃度20-100IU/ml的IL-12、終濃度20-100IU/ml的IL-15的免疫細胞培養基；
3)以NK細胞完全培養基配制CD16Mab包被液：NK細胞完全培養基中含有4-8ug/ml的CD16Mab；
4)在細胞培養瓶中加入1-5mlCD16Mab包被液，包被4-24h；
5)將單個核細胞按照3-8*105/ml的細胞終濃度接種到預包被CD16Mab的細胞培養瓶中，加入NK細胞誘導培養基以及終濃度500-1000IU/ml的IFN-r,誘導擴增NK細胞；
6)每3-4天將每瓶細胞懸液平均分配到2個以CD16Mab包被液預包被4-24h的細胞培養瓶中，并補加1-2倍體積的NK細胞誘導培養基；
7)培養的第19-20天收集所有細胞培養瓶中的全部細胞。
具體地說，包括以下步驟：
1)以Ficoll淋巴細胞分離液從外周血中分離獲得單個核細胞；
2)配制NK細胞完全培養基：含有體積分數5-8％的FBS，以及終濃度500-1000IU/ml的IL-2、終濃度20-100IU/ml的IL-12、終濃度20-100IU/ml的IL-15的免疫細胞培養基；
3)CD16Mab包被液的配制：NK細胞完全培養基中含有4-8ug/ml的CD16Mab；
4)將步驟1)獲得的細胞按照3-8*105/ml的細胞終濃度接種到提前加入了5mlCD16Mab包被液，在4℃條件下包被了4-24h的T-175細胞培養瓶中，加入NK細胞完全培養基至培養體系為50-100ml,并按照終濃度500-1000IU/ml加入IFN-r，開始誘導培養；
5)誘導培養的第4天，在培養體系中加入等體積的NK細胞完全培養基繼續培養；
6)培養的第6天，取2個新的T-175細胞培養瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃條件下包被4-24h；
7)培養的第7天，將誘導培養的NK細胞懸液混合均勻后平均加入到2個包被好的T-175細胞培養瓶中，并加入等體積的NK細胞完全培養基繼續培養；
8)培養的第9天，取4個新的T-175細胞培養瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃條件下包被4-24h；
9)培養的第10天，將誘導培養的NK細胞懸液混合均勻后平均加入到4個包被好的T-175細胞培養瓶中，并加入等體積的NK細胞完全培養基繼續培養；
10)培養的第12天，取8個新的T-175細胞培養瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃條件下包被4-24h；
11)培養的第13天，將誘導培養的NK細胞懸液混合均勻后平均加入到8個包被好的T-175細胞培養瓶中，并加入等體積的NK細胞完全培養基繼續培養；
12)培養的第15天，取16個新的T-175細胞培養瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃條件下包被4-24h；
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