[發明專利]一種六次甲基四胺的檢測方法

有效

• 申請號: 201610330766.5
• 申請日: 2015-05-08
• 公開（公告）號: CN106018793B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 王庭欣;周麗巖;孟墨;龐艷榮;王庭祥;謝飛;任勃儒
• 申請（專利權）人: 河北大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/531;G01N33/543
• 代理公司: 石家莊國域專利商標事務所有限公司13112
• 代理人: 白海靜

1.一種六次甲基四胺的檢測方法，其特征在于，采用試劑盒檢測六次甲基四胺，包括以下步驟：

所述試劑盒，包括：

檢測卡；所述檢測卡包括硝酸纖維素膜，在所述硝酸纖維素膜上設有一條含六次甲基四胺包被抗原的檢測帶和一條含有羊抗兔二抗的質控帶；

膠體金標記六次甲基四胺多克隆抗體復合物；以及

磷酸鹽緩沖稀釋液；

（1）預處理待測樣品；

（2）將所述膠體金標記六次甲基四胺多克隆抗體復合物與磷酸鹽緩沖液按1:2混合，將處理后的待測樣品與所述膠體金標記六次甲基四胺多克隆抗體復合物和磷酸鹽緩沖液的混合物按體積比為1:5混合，得混合液；

（3）將所述混合液逐滴加到所述檢測卡的檢測帶與質控帶之間的區域上； 靜置10-15min，觀察，若質控帶和檢測帶都顯紅色，則待測樣品為陰性，即表明待測樣品中不含六次甲基四胺或其含量小于 0.5ng/ml 最低檢出限；若僅質控帶顯紅色，則待測樣品為陽性，即表明待測樣品中含有六次甲基四胺且含量大于所述最低檢出限，若質控帶均不顯色，則該測試無效；

所述試劑盒中膠體金標記六次甲基四胺多克隆抗體復合物的制備工藝包括以下步驟：

（A）合成六次甲基四胺完全抗原：配制濃度為 200-300 mg/ml 的六次甲基四胺溶液；配制pH值為7-10、離子濃度為10-1000 mmol、含載體蛋白30-50 mg/ml的復合磷酸鹽緩沖液； 所述載體蛋白為牛血清白蛋白；將所述六次甲基四胺溶液滴加到所述復合磷酸鹽緩沖液中，再加入體積比濃度為25%的戊二醛水溶液，混勻，室溫靜置1-2小時，4℃冰箱過夜，再裝入透析袋中，透析 3-5 天，每天換液 1-2 次，得六次甲基四胺完全抗原；所述六次甲基四胺:復合磷酸鹽緩沖液:戊二醛水溶液質量體積比為：80-120 mg : 1-5ml : 2-3ml；

（B）制備六次甲基四胺多克隆抗體：用所述六次甲基四胺完全抗原進行動物免疫，獲得六次甲基四胺多克隆抗體；

（C）制備膠體金溶液：將100 ml質量比濃度為0.01%的HAuCl₄ 的水溶液邊攪拌邊加熱至沸騰，保持煮沸2-3 min，攪拌，加入1.2 ml質量比濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液，待溶液顏色變為透明的紅色并不再變化時，保持煮沸 15 min，停止加熱，攪拌，冷卻至室溫，添加蒸餾水恢復溶液至100 ml；

（D）制備膠體金標記六次甲基四胺多克隆抗體復合物：調節膠體金溶液的pH值為8-10， 按體積比1:0.06取所述膠體金溶液和所述六次甲基四胺多克隆抗體，在磁力攪拌下，將所述六次甲基四胺多克隆抗體逐滴加入到所述膠體金溶液中，10-15 min后向溶液中逐滴加入牛血清白蛋白，使溶液中所述牛血清白蛋白的終濃度達到1-2%，攪拌 30-40min，置于4℃下過夜； 在 4℃下1500r/min離心10min，取上清液于4℃下、10000r/min離心30min，棄去上清液，得膠體金標記六次甲基四胺多克隆抗體復合物。

2.根據權利要求1所述的六次甲基四胺的檢測方法，其特征在于，步驟（B）所述的制備六次甲基四胺多克隆抗體的工藝為：采用初次免疫制劑對兩只雄性大耳白家兔進行初次免疫，之后用加強免疫制劑分別于初次免疫后的第2周、4周、8周、12周各加強免疫1次，采用背部皮下脊柱兩側多點進行免疫，于最后一次免疫完第10天，從兔子的耳緣靜脈取血，將血清收集于離心管中，室溫靜置30-35min，待血漿凝聚后，4℃靜置過夜，將血清以3000 r/min離心15-20 min，得到的上清液為六次甲基四胺多克隆抗血清。

3.根據權利要求2所述的六次甲基四胺的檢測方法，其特征在于，所述初次免疫制劑的制備工藝為將所述六次甲基四胺完全抗原按體積比為1:4溶于磷酸鹽緩沖液中，得抗原磷酸緩沖液，在抗原磷酸緩沖液中加入與其等體積的弗氏完全佐劑，乳化即得；所述加強免疫制劑的制備工藝為將所述六次甲基四胺完全抗原按體積比為1:9溶于磷酸鹽緩沖液中，得加強抗原磷酸緩沖液，在加強抗原磷酸緩沖液中加入與其等體積的弗氏不完全佐劑，乳化即得；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01 mol/L，pH值為7.4。

4.根據權利要求1所述的六次甲基四胺的檢測方法，其特征在于，所述試劑盒檢測卡的六次甲基四胺包被抗原的制備工藝為：配制濃度為15-25mg/ml的六次甲基四胺溶液；配置濃度為0.1mol/L、pH值為7.4、含有卵清蛋白4.5-5.0mg/ml的磷酸鹽緩沖液；將六次甲基四胺溶液緩慢滴加到含卵清蛋白磷酸緩沖溶液中，之后，再加入體積比濃度為25%戊二醛水溶液，混勻，室溫靜置1小時，4℃靜置過夜，裝入透析袋，4℃下在0.01mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中連續透析5天，每天換液1次，得到的六次甲基四胺包被抗原；所述六次甲基四胺: 含卵清蛋白的磷酸緩沖溶液:戊二醛水溶液的添加比例為5-6 mg : 2-5ml : 1-2 ml。