[發明專利]一種骨標志物檢測用免疫層析試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201610326807.3
• 申請日: 2016-05-17
• 公開（公告）號: CN106018788B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 金鑫;曾濱;趙正道
• 申請（專利權）人: 北京美康基因科學股份有限公司;南京美寧康誠生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533
• 代理公司: 北京東方匯眾知識產權代理事務所(普通合伙)11296
• 代理人: 張淑賢

1.一種骨標志物檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，所述試劑盒包括塑料板、設置在塑料板上的玻璃纖維素膜、設置在玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設有樣本墊，對應的另一端設有吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點標記的Ⅰ型膠原羧基末端肽抗體、量子點標記的骨鈣素抗體和量子點標記的Ⅰ型前膠原氨基端前肽抗體的混合物；所述硝酸纖維素膜上設置有檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，所述檢測線1上包被有Ⅰ型膠原羧基末端肽二抗，所述檢測線2上包被有骨鈣素二抗，所述檢測線3上包被有Ⅰ型前膠原氨基端前肽二抗，所述控制線上包被有羊抗鼠lgG；

制備方法包括以下操作步驟：

1)原材料的制備：

A：制備玻璃纖維素膜：將量子點標記的Ⅰ型膠原羧基末端肽抗體、量子點標記的骨鈣素抗體、量子點標記的Ⅰ型前膠原氨基端前肽抗體混合包被在玻璃纖維素膜上，干燥，備用；

B：制備硝酸纖維素膜：取硝酸纖維素膜，間隔劃分出檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，然后將Ⅰ型膠原羧基末端肽二抗、骨鈣素二抗、Ⅰ型前膠原氨基端前肽二抗、羊抗鼠lgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上，之后將包被后的硝酸纖維素膜放入封閉液中封閉，干燥，備用；

2)組裝：在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素模，然后在步驟1)制備的玻璃纖維素膜上放置步驟1)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應的另一端放置吸水墊，干燥，即完成；

步驟A中還包括首先制備量子點標記的Ⅰ型膠原羧基末端肽抗體、量子點標記的骨鈣素抗體和量子點標記的Ⅰ型前膠原氨基端前肽抗體的混合物，具體方法包括以下操作步驟：

a：在膠乳顆粒懸濁液中加入改性環糊精，混勻24小時，純化，得改性環糊精‐膠乳復合物懸濁液；

b：在步驟a制備的改性環糊精‐膠乳復合物懸濁液中加入量子點，混勻24小時，純化，得量子點‐改性環糊精‐膠乳復合物懸濁液；

c：在步驟b制備的量子點‐改性環糊精‐膠乳復合物懸濁液中加入活化劑，活化15分鐘，純化，之后加入Ⅰ型膠原羧基末端肽抗體，混勻2～4小時后，離心得沉淀物顆粒，將沉淀物顆粒用封閉液重懸，室溫混勻1小時，之后再進行純化，即得量子點標記的Ⅰ型膠原羧基末端肽抗體；

d：按照上述步驟a～c同樣的方法制備量子點標記的骨鈣素抗體和量子點標記的Ⅰ型前膠原氨基端前肽抗體，然后將量子點標記的Ⅰ型膠原羧基末端肽抗體、量子點標記的骨鈣素抗體和量子點標記的Ⅰ型前膠原氨基端前肽抗體混合，備用。

2.如權利要求1所述的骨標志物檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，所述改性環糊精為羧甲基化改性環糊精或氨基化改性環糊精。

3.如權利要求1所述的骨標志物檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟a中所述改性環糊精與膠乳顆粒的質量比為20：1；步驟b中所述量子點與環糊精‐乳膠復合物的質量比為10：1；步驟c中所述Ⅰ型膠原羧基末端肽抗體與量子點‐改性環糊精‐膠乳復合物的質量比為1：20。

4.如權利要求1所述的骨標志物檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟A中將量子點標記的Ⅰ型膠原羧基末端肽抗體、量子點標記的骨鈣素抗體、量子點標記的Ⅰ型前膠原氨基端前肽抗體混合包被在玻璃纖維素膜上的具體方法為：將量子點標記的Ⅰ型膠原羧基末端肽抗體、量子點標記的骨鈣素抗體和量子點標記的Ⅰ型前膠原氨基端前肽抗體混合物均勻噴涂于玻璃纖維素膜上。

5.如權利要求1所述的骨標志物檢測用免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟B中將Ⅰ型膠原羧基末端肽二抗、骨鈣素二抗、Ⅰ型前膠原氨基端前肽二抗、羊抗鼠lgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上的具體方法為：分別取濃度均為1mg/ml的Ⅰ型膠原羧基末端肽二抗、骨鈣素二抗、Ⅰ型前膠原氨基端前肽二抗和羊抗鼠IgG，以1ul/cm，10cm/秒的速度分別噴涂到硝酸纖維的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上。

6.一種骨標志物檢測用免疫層析試劑盒，其特征在于，由如權利要求1～5任一項所述的制備方法制備而成。