[發(fā)明專(zhuān)利]一種從中華鱟尾中制備犬尿酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610326173.1
• 申請(qǐng)日: 2016-05-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105801480B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李健;蘇文金;劉鵬飛;蘇國(guó)成;劉靜雯;王力
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 集美大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07D215/48
• 分類(lèi)號(hào): C07D215/48
• 代理公司: 廈門(mén)創(chuàng)象知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司35232
• 代理人: 賴(lài)慶梧,尤懷成

1.一種從中華鱟尾中制備犬尿酸的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一、中華鱟尾干粉的制備：將中華鱟尾自然晾曬干燥，在常溫下，用藥用粉碎機(jī)粉碎，得到干粉，裝于密封袋中，于干燥器中保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟二、稱(chēng)取已經(jīng)打粉的中華鱟尾5份，每份1000g，分別置于5個(gè)2L的三角瓶中，按料液比1:3:16分別加入乙酸、乙酸乙酯和甲醇，封口后置于搖床中，在40℃，150rpm條件下進(jìn)行第一次提取48h，抽濾，收集濾液；再向殘?jiān)屑尤胂鄳?yīng)溶劑進(jìn)行第二次提取，在同樣的條件下提取24h，抽濾，收集濾液，待殘?jiān)腥軇]干后，再交換溶劑提取1次，進(jìn)行第三次提取，在同樣的條件下提取，合并濾液，45℃減壓濃縮至圓底燒瓶中，回收溶劑，分別得有機(jī)提取物浸膏，合并提取物浸膏，得到中華鱟尾粗提 物，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

步驟三、中華鱟尾粗提 物的初步分離純化：將中華鱟尾粗提 物用甲醇溶解后過(guò)濾，40℃減壓濃縮后，用硅膠粉干法拌樣，上6cm×35cm反相硅膠柱，用100%水進(jìn)行洗脫，洗脫體積為2L，每250ml收集一個(gè)組分，共得到8個(gè)餾分，45℃進(jìn)行減壓濃縮后除去溶劑后，合并得到組分A；

步驟四、組分A的分離純化：組分A用適量甲醇溶解后，直接上Sephadex LH20凝膠柱，用甲醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，控制流速為8-9s/drop，使用自動(dòng)收集器收集各餾分，每60min收集1管，共收集得到130管餾分；合并第123管至第130管的餾分，再進(jìn)行減壓濃縮，得到組分A8；

步驟五、組分A8的分離純化：組分A8用適量甲醇溶解后，直接上Sephadex LH20正相硅膠柱，用甲醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，經(jīng)若干次凝膠柱分離，最終收集得到40管餾分，合并24管至35管餾分得到樣品，將該部分樣品標(biāo)記為組分A8-24；

步驟六、組分A8-24的分離純化：取組分A8-24 加適量甲醇溶解后，過(guò)正相柱分離；用硅膠粉拌樣，硅膠用石油醚飽和后裝柱，樣品上柱后，用石油醚與丙酮進(jìn)行洗脫，收集石油醚：丙酮=1:10時(shí)的餾分，共60管，合并25管至40管，合并餾分后減壓濃縮，蒸干溶劑后，制得犬尿酸。

2.如權(quán)利要求1所述的一種從中華鱟尾中制備犬尿酸的方法，其特征在于：所述步驟五中采用的正相硅膠進(jìn)行分離的步驟：

a、硅膠粉活化：

取200~300目硅膠粉于試劑瓶中，用扎孔的錫箔紙包好瓶口，置于110℃

烘箱中活化2~3h，冷卻后封好瓶口置于干燥器中，備用；

b、拌樣：

根據(jù)樣品的量50mg，向潔凈的圓底燒瓶中加入硅膠粉150mg，用膠頭滴管吸取樣品液滴至圓底燒瓶中的硅膠粉上，迅速攪拌均勻并間歇用電吹風(fēng)給圓底燒瓶加熱以使溶劑快速揮干，使樣品呈均勻粉末狀，如此重復(fù)，直至樣品全部吸附于硅膠粉上，繼續(xù)加熱，使樣品中的溶劑完全揮發(fā)，用濾紙封口后置于干燥器中備用；

c、裝柱：

采用濕法裝柱，稱(chēng)取5g硅膠粉用石油醚飽和后裝柱；

d、上樣：

采用干法上樣，將吸附有樣品的硅膠粉裝至層析柱中，使其均勻沉降于硅膠層表面，待樣品沉降完全，打開(kāi)閥門(mén)，收集洗脫液；

e、樣品洗脫：

梯度洗脫：先用初始洗脫劑對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，然后逐漸增加洗脫劑的極性，洗脫過(guò)程中用泵加壓并用薄層層析TLC追蹤，直至目標(biāo)點(diǎn)被洗脫；

f、樣品的收集與合并：

用小試管分步收集樣品，將含有目標(biāo)點(diǎn)的樣品管按照出柱順序合并為幾個(gè)部分，減壓濃縮后，繼續(xù)進(jìn)行薄層層析，根據(jù)樣品的具體情況繼續(xù)進(jìn)行分離或者合并濃縮后4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

3.如權(quán)利要求2所述的一種從中華鱟尾中制備犬尿酸的方法，其特征在于：所述薄層層析TLC追蹤為：將GF254硅膠板于110℃烘箱中活化2~3h，待其自然冷卻至室溫后取出，置于干燥器中備用，用玻璃毛細(xì)管吸取適量樣品，點(diǎn)于硅膠板基線上，并在樣點(diǎn)下端用鉛筆做好標(biāo)記，硅膠板上基線距板底端距離為0.8~1cm，兩樣點(diǎn)之間的距離不小于0.8cm，用吹風(fēng)機(jī)吹干溶劑后，置于裝有飽和層析液的層析缸中展開(kāi)，待溶劑前沿展至距薄層板頂端約1cm時(shí)，用鑷子取出，吹干溶劑，用紫外分析儀和其它顯色劑進(jìn)行顯色。

4.如權(quán)利要求1所述的一種從中華鱟尾中制備犬尿酸的方法，其特征在于：還包括犬尿酸的結(jié)構(gòu)鑒定：將過(guò)正相硅膠柱后制得的犬尿酸裝入核磁管中，蒸干溶劑，加入氘代試劑，以TMS作為內(nèi)標(biāo)，使用400MH核磁共振儀測(cè)定化合物的核磁譜，測(cè)定項(xiàng)目包括¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT 90、DEPT 135、¹H-¹HCOSY、HSQC、HMBC；將樣品用含5%甲酸的甲醇溶液溶解后測(cè)定質(zhì)譜，質(zhì)譜條件：電離源：電噴霧電離源；干燥氣溫度：200℃；干燥氣壓力：20psi；霧化氣壓力：50psi；霧化室溫度50℃；針孔電壓：5000V；屏蔽電壓：600V；毛細(xì)管電壓：80V。