[發(fā)明專利]一株噻蟲啉、啶蟲脒單克隆抗體雜交瘤細胞株GW及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610324649.8
• 申請日: 2016-05-17
• 公開（公告）號: CN105754955B
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胥傳來;姚蕾珺;匡華;徐麗廣;馬偉;劉麗強;吳曉玲;宋珊珊;胡擁明
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務(wù)所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一株噻蟲啉、啶蟲脒單克隆抗體雜交瘤細胞株GW及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測領(lǐng)域。本發(fā)明噻蟲啉、啶蟲脒完全抗原與等量QuickAntibody?Mouse 5W佐劑混合均勻，通過大腿肌肉注射BALB/c小鼠。首次免疫100μg/只，多次加強免疫50μg/只，每次免疫間隔21天，最后一次用噻蟲啉、啶蟲脒完全抗原（25μg/只，不含佐劑）沖擊免疫。取高效價低IC₅₀小鼠的脾細胞，通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細胞融合，經(jīng)過間接競爭酶聯(lián)免疫法篩選和三次亞克隆，得到一株雜交瘤細胞株。此細胞株分泌的單克隆抗體，對噻蟲啉、啶蟲脒具有較好的特異性和檢測靈敏度（IC₅₀值分別為0.1 ng/mL、0.4 ng/mL），可實現(xiàn)對水、果蔬、谷物中噻蟲啉、啶蟲脒殘留量的檢測，為食品中噻蟲啉、啶蟲脒殘留的免疫檢測提供了條件，具有實際應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株噻蟲啉、啶蟲脒單克隆抗體雜交瘤細胞株GW及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

噻蟲啉、啶蟲脒均屬煙堿類殺蟲劑，是煙堿型乙酰膽堿受體的作用體，目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已廣泛使用，噻蟲啉屬低毒類殺蟲劑，啶蟲脒屬中毒殺蟲劑。此兩種藥主要作用于昆蟲神經(jīng)接合后膜，通過與煙堿乙酰膽堿受體結(jié)合，干擾昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)正常傳導(dǎo)，引起神經(jīng)通道的阻塞，造成乙酰膽堿的大量積累，從而使昆蟲異常興奮，全身痙攣、麻痹而死。具有較強的觸殺、胃毒和內(nèi)吸作用。多用于水果、蔬菜等防除大多數(shù)害蟲。有文章報道，煙堿類殺蟲劑暴露可能會對哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生影響。在歐盟食品安全局（EFSA）審查發(fā)現(xiàn)煙堿類殺蟲劑對蜜蜂有害之后，近兩年歐盟已限制了煙堿類殺蟲劑藥在一些作物上的使用。

目前檢測噻蟲啉、啶蟲脒色譜法應(yīng)用最為廣泛，包括氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)、超臨界流體色譜(SFC)、毛細管電泳(CE)等的儀器方法，但這些方法需要昂貴的儀器、專業(yè)的操作人員，且樣品前處理復(fù)雜，成本高，時間長，不能實現(xiàn)大量樣品的快速檢測，因此建立快速簡便的噻蟲啉、啶蟲脒檢測方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現(xiàn)場快速檢測。建立高效的免疫學(xué)檢測方法，篩選高特異性的單克隆抗體是重要前提。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種噻蟲啉、啶蟲脒具有高特異性和檢測靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備方法。提供一株抗噻蟲啉、啶蟲脒單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備的抗體對噻蟲啉、啶蟲脒具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立噻蟲啉、啶蟲脒的免疫學(xué)檢測方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案，一株噻蟲啉、啶蟲脒單克隆抗體雜交瘤細胞株GW，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No.12014。

抗噻蟲啉、啶蟲脒單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCC No.12014的噻蟲啉、啶蟲脒單克隆抗體雜交瘤細胞株GW分泌產(chǎn)生。

所述抗噻蟲啉、啶蟲脒單克隆抗體的應(yīng)用，用于食品安全檢測中噻蟲啉、啶蟲脒的分析檢測。

本發(fā)明提供的GW細胞株的制備基本步驟為：

1）半抗原的合成：

將啶蟲脒原藥1 （2.2g，10 mmol），巰基丙酸（2.12 g，2eq），Cs₂CO₃（32.6g，10eq）混懸于己二酸二甲酯（40mL）中，120℃下反應(yīng)16 h（過夜），冷至室溫，加入四氫呋喃（50 mL）后過濾，所得固體粗品（35g，易吸潮）加入少量水中，prep-HPLC純化，最后得到70mg半抗原ATPA。用液質(zhì)聯(lián)用分析法進行鑒定與分析；