[發明專利]一種手足口病病原膠體金診斷檢測試紙盒的制備方法

在審

• 申請號: 201610323778.5
• 申請日: 2016-05-16
• 公開（公告）號: CN105785018A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 楊躍進;胡軍;鞏飚;劉杰;曹曉;胡淮潔;黃淑華;陳磊;張春艷;閻學燕;許姣;王雪
• 申請（專利權）人: 開封市疾病預防控制中心
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶孟民

1.一種手足口病病原膠體金診斷檢測試紙盒的制備方法，其特征在于，首先將反應膜 （4）粘貼到背襯（7）中心上，反應膜（4）上噴涂檢測線（3）和對照線（5），再將吸水墊（6）壓到 反應膜（4）靠近背襯末端的一側，膠體金墊（2）壓到反應膜（4）的另一側，樣品墊（1）壓到膠 體金墊（2）的另一側，樣品墊、膠體金墊、反應膜和吸水墊皆用強力膠固定于背襯上，用切條 機沿背襯橫截面方向切成4mm寬的條，將試紙條裝在試紙殼（8）內，試紙殼（8）上開有樣本孔 （9）和檢測結果區（10）；

所述的樣品墊（1）是由樣品處理液和玻纖膜制成，方法是，由20g牛血清白蛋白、5g曲拉 通-100和0.01mol、pH為7.4的磷酸緩沖液加水至1000ml制成樣品處理液，把玻纖膜裁切成 22mm寬的條，然后在每0.8cm長的玻纖膜上噴涂100μL樣品處理液，37℃干燥過夜，成樣品墊 （1）；

所述的膠體金墊（2）是由玻纖膜上噴涂金標抗體液制成，方法是，將玻纖膜裁切成7mm 寬的條，每1.7cm長的玻纖膜上噴涂100μL金標抗體液，冷凍真空干燥或加入干燥劑晾干，再 密閉在密閉容器中靜置12小時，即成膠體金墊（2）；

金標抗體液的制備，方法是：

1）膠體金稀釋液的配制，膠體金稀釋液是由10g牛血清白蛋白、25g蔗糖、0.5g吐溫-20、 1g疊氮鈉和0.01mol、pH為7.4的磷酸緩沖液加水至1000mL制成；

2）膠體金顆粒溶液的配制：取質量濃度為0.01%氯金酸水溶液50ml，微波加熱至煮沸， 加入質量濃度為1%檸檬酸三鈉水溶液600μL，加熱至出現酒紅色，再加入50ml、4℃預冷的電 導率為18.25的純凈水，即成40nm膠體金顆粒溶液，膠體金顆粒溶液吸收峰波長為532- 534nm；Abs大于0.400；

3）膠體金標記抗體的配制：取膠體金顆粒溶液10ml，磁力攪拌下，加入體積濃度為30% 的雙氧水水溶液32μL；室溫磁力攪拌混合10min，再加入0.2M的碳酸鉀水溶液300μL，室溫磁 力攪拌10min，加入0.2mg純化凍干的抗手足口病病原單克隆抗體CE-6，抗手足口病病原單 克隆抗體CE-6凍干前緩沖液為0.01M，pH7.4的磷酸緩沖液；室溫磁力攪拌60min，加入0.1g 牛血清白蛋白，室溫磁力攪拌混勻10min后，再加入0.01g聚乙二醇6000，室溫磁力攪拌 30min，得金標抗體，將金標抗體移入離心管，在4℃，用HimacCR21G離心機濃縮，8000rpm離 心10min，棄去上清，得酒紅色沉淀，即為膠體金標記抗體；

4）金標抗體液的配制：膠體金標記抗體用膠體金稀釋液溶解以置換溶液體系，然后用 膠體金稀釋液稀釋金標抗體，稀釋后的金標抗體最高吸收峰波長532-534nm，吸光度大于 0.400Abs；

所述的檢測線（3）和對照線（5）分別是由檢測抗體點膜液、對照抗體點膜液噴涂在反應 膜（4）上制成，方法是：

1）配制點膜稀釋液：由0.01mol、pH為7.4的磷酸緩沖液，0.15mol氯化鈉，10mol乙二胺 四乙酸，1g疊氮鈉，30g的甲醇加水至1000mL制成；

2）配制檢測抗體點膜液：將純化凍干的抗手足口病病原單克隆抗體CE-24用點膜稀釋 液稀釋至2mg/mL，抗手足口病病原單克隆抗體CE-24純度大于90%，比活性大于10^-5效價/mg 蛋白；

3）配制對照抗體點膜液：將比活性大于10^-7/mg的山羊抗小鼠多抗用點膜稀釋液稀釋至 0.8mg/mL；

4）制備檢測線和對照線：先將反應膜貼到背襯的相應位置，再用點膜機將檢測抗體點 膜液及對照抗體點膜液劃到反應膜上的相應位置，檢測線和對照線的噴制均按每厘米檢測 線用2μL點膜液噴制，室溫晾干，即成。

2.根據權利要求1所述的手足口病病原膠體金診斷檢測試紙盒的制備方法，其特征在 于，所述的反應膜（4）的材質是硝酸纖維素膜，型號為：MILLIPORE,M135，制備時將反應膜裁 切成寬度為25mm的條；所述的吸水墊（6）的材質是加厚吸水紙，將加厚吸水紙裁切成寬度為 26mm的條，然后將其粘貼到背襯相應位置上即可。