[發(fā)明專(zhuān)利]一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610323492.7
• 申請(qǐng)日: 2016-05-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105779315A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?jiān)榔?/a>;陳光宇;瞿華香;周勁松;湯泳萍;趙萍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/15
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/15;C12N15/65;C12N15/80;C12R1/645
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子的制備方法，其 特征在于，以蘆筍莖枯病菌的分生孢子為受體，以農(nóng)桿菌為介體，將 蘆筍莖枯病菌的分生孢子懸浮液與含有雙元載體的農(nóng)桿菌混合后共 培養(yǎng)，制備蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)制備蘆筍莖枯病菌的分生孢子：將蘆筍莖枯病菌接種于馬 鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，活化培養(yǎng)；將活化培養(yǎng)后的蘆筍莖枯病菌 接種于燕麥瓊脂糖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至分生孢子器中乳白色分生孢子溢 出；

(2)將已轉(zhuǎn)入雙元表達(dá)載體的農(nóng)桿菌單菌落接種于LB固體培 養(yǎng)基中培養(yǎng)后，再將農(nóng)桿菌單菌落接種液體基本培養(yǎng)基MM中培養(yǎng) 得到農(nóng)桿菌懸浮液；

(3)用含有乙酰丁香酮和2-(N-嗎啉基)乙磺酸鈉的液體誘導(dǎo) 培養(yǎng)基IM稀釋步驟(2)制得的農(nóng)桿菌懸浮液至OD600值為0.15-0.20， 繼續(xù)在28℃條件下振蕩培養(yǎng)，至OD600值為0.25-0.35備用；

(4)農(nóng)桿菌與蘆筍莖枯病菌分生孢子共培養(yǎng)：

將步驟(1)獲得的蘆筍莖枯病菌分生孢子用水稀釋為濃度為1 ×10⁶-5×10⁶個(gè)分生孢子/mL；

將步驟(3)得到的OD600值為0.25-0.35的農(nóng)桿菌懸浮液與上 述濃度為1×10⁶-5×10⁶個(gè)分生孢子/mL分生孢子懸浮液按照體積比 1:1混合，混合液均勻涂布于鋪有硝酸纖維素膜的改良型共培養(yǎng)誘導(dǎo) 培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

(5)將步驟(4)中的硝酸纖維素膜放于含有潮霉素B和頭孢噻 肟的篩選培養(yǎng)基SM中，使有菌絲的一面朝上，恒溫培養(yǎng)；

將長(zhǎng)出蘆筍莖枯病菌的菌落轉(zhuǎn)移至含有潮霉素B的PDA平板培 養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，將生長(zhǎng)的菌落再次接種至含有潮霉素B的PDA平 板培養(yǎng)基上，連續(xù)培養(yǎng)得到純凈的蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中， 活化培養(yǎng)條件為23-27℃3-6d；活化培養(yǎng)后的蘆筍莖枯病菌接種于燕 麥瓊脂糖培養(yǎng)基上的培養(yǎng)條件為23-27℃，14-21d。

4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的固 體培養(yǎng)基為含卡那霉素和利福平的LB固體培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為28 ℃培養(yǎng)2-3d；

步驟(2)所述液體基本培養(yǎng)基MM含50μg/mL卡那霉素，培 養(yǎng)條件為28℃振蕩培養(yǎng)2-3d，振速150-180rpm。

5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的液 體誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM含150-250μM乙酰丁香酮和35-45mM2-(N-嗎啉 基)乙磺酸鈉。

6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(4)的改良型 共培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基含3-6mM葡萄糖、150-250μM乙酰丁香酮、35-45 mM2-(N-嗎啉基)乙磺酸鈉，培養(yǎng)條件為23-27℃共培養(yǎng)2-4d。

7.如權(quán)利要求2-6任一所述的方法，其特征在于，步驟(5)的 篩選培養(yǎng)基SM含40-100μg/mL潮霉素B和150-250μM頭孢噻肟。

8.如權(quán)利要求2-6任一所述的方法，其特征在于，步驟(5)的 PDA平板培養(yǎng)基含40-100μg/mL潮霉素B。

9.權(quán)利要求1-8任一所述的方法制備得到的蘆筍莖枯病菌遺傳 轉(zhuǎn)化子。

10.權(quán)利要求1-8任一所述的方法在制備蘆筍莖枯病菌特異性熒 光標(biāo)記菌株中的應(yīng)用。