[發明專利]一種對蝦胚胎細胞的分離與培養方法

有效

• 申請號: 201610322759.0
• 申請日: 2016-05-16
• 公開（公告）號: CN105754928B
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 郭華榮;張曉娟;陳月如
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種對蝦胚胎細胞的培養方法，其特征在于，所述的培養方法是將分離的對蝦胚胎細胞懸液接種到培養瓶或培養板中，于28℃，3% CO₂培養箱中靜置培養；每2天更換一半體積的對蝦完全培養基；

所述的對蝦胚胎細胞懸液，其制備方法如下：

將清洗保存的對蝦胚胎轉移到已滅菌的研缽內，棄除多余培養基；用已滅菌的胚胎細胞收集器的弧形不銹鋼濾網擠壓對蝦胚胎來搗碎受精膜，使胚胎細胞游離出來；然后取新鮮的對蝦基礎培養基，沖洗不銹鋼濾網，收集所有胚胎細胞和細胞團，再用對蝦基礎培養基，沉降法洗滌1-2次，至澄清透明，最后用對蝦完全培養基懸浮胚胎細胞和細胞團獲得對蝦胚胎細胞懸液；

所述的對蝦基礎培養基的制備方法如下：在1升超純水中溶解20.55 g L-15培養基、5g NaCl、2 g葡萄糖、1 g NaHCO₃、0.01 g牛磺酸、0.01 g脯氨酸、1.0×10⁵ IU 青霉素鈉和100mg硫酸鏈霉素，調節pH值至7.2-7.4，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存；

所述的對蝦完全培養基的配制方法如下：每升上述對蝦基礎培養基中，添加8%胎牛血清、20μg堿性成纖維細胞生長因子和 20μg表皮生長因子，pH7.2-7.4；用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌完成制備；

所述的清洗保存的對蝦胚胎，是用吸管收集對蝦胚胎至離心管中，無菌海水洗滌5-6次，再將胚胎轉移到70目不銹鋼濾網中，淘洗數次后，流水連續沖洗1-2 h，然后用10%碘伏處理5-10分鐘，再用75%酒精漂洗20-30秒去除碘伏；然后依次用添加有2000 IU/mL青霉素和鏈霉素的無菌海水和PBS漂洗去除酒精；最后暫存于對蝦基礎培養基中。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的無菌海水是將天然海水依次經過16-20層紗布和0.22μm濾膜過濾后，高壓蒸汽滅菌制成的。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PBS溶液的配制方法如下：分別稱取8.0 g NaCl，0.2 g KCl，3.0 g Na₂HPO₄·12H₂O和0.2 g的KH₂PO₄溶于1 L純水中，溶解，用3M NaOH調節pH值至7.2~7.4，121℃高壓滅菌20分鐘，分裝后4℃保存備用。