[發明專利]利用Pcry3Aa啟動子構建高表達海藻糖合成酶工程菌的方法

有效

• 申請號: 201610322282.6
• 申請日: 2016-05-16
• 公開（公告）號: CN105779489B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 王騰飛;劉強;王瑞明
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/66;C12N15/61;C12N1/21;C12N9/90;C12R1/125
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

1.一種利用Pcry3Aa啟動子構建高表達海藻糖合成酶工程菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）以枯草芽孢桿菌168基因組的DNA為模板，PCR擴增獲得片段SpoIIID-1；所述SpoIIID-1基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

（2）以質粒pBRNeo為模板，PCR擴增卡那霉素抗性基因Km^r片段，制得Km^r片段；所述卡那霉素抗性基因Km^r片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

（3）通過重疊PCR擴增技術，將步驟（1）制得的片段SpoIIID-1與步驟（2）制得的卡那霉素抗性基因Km^r片段進行重疊PCR，擴增得到SpoIIID-1-Km^r片段；

（4）將步驟（3）制得的SpoIIID-1-Km^r片段經BamHI內切酶酶切后轉化到枯草芽孢桿菌WB800n中，篩選有卡那霉素抗性的克隆轉化子，制得sigK基因不表達的枯草芽孢桿菌WB800n [ΔSpoIIID]菌株；

（5）將重組質粒Pcry3Aa-PhoD-PHT01-TreS轉化步驟（4）制得的重組枯草芽孢桿菌WB800n [ΔSpoIIID]菌株，篩選有氯霉素抗性的克隆轉化子，制得高表達海藻糖合成酶工程菌WB800n [ΔSpoIIID]+[Pcry3Aa-PhoD-PHT01-TreS]菌株；

所述重組質粒Pcry3Aa-PhoD-PHT01-TreS為在穿梭質粒PHT01的酶切位點BamHI上游插入通過重疊PCR得到的將Pcry3Aa啟動子片段和PhoD信號肽片段連接的Pcry3Aa-PhoD片段，在BamHI和AatII兩個酶切位點之間插入目的蛋白海藻糖合成酶TreS片段；所述的Pcry3Aa啟動子片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； PhoD信號肽片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；海藻糖合成酶TreS片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，所述片段SpoIIID-1的PCR擴增引物序列如下：

上游引物SpoIIID-1-F：5’-CGCGGATCCGCGGGCGCTTTGGTTGATTTGAT-3’；

下游引物SpoIIID-1-R：

5’-TCTTGTTCAATCATTGGAAACACCAAATTCCTTCGCAATGAC-3’；

單下劃線為BamHI酶切位點；片段SpoIIID-1為SpoIIID基因前100bp和SpoIIID基因上游的400bp的整個片段；

所述片段SpoIIID-1的PCR擴增體系為50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，濃度為10μmol/L的上游引物2.5μl，濃度為10μmol/L的下游引物 2.5μl，模板 2.5μl，用ddH₂O補足50μl；

所述的PCR擴增程序如下：

95℃預變性5min；95℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，30個循環；72℃延伸10min，-20℃保存。