[發明專利]一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法

有效

• 申請號: 201610320756.3
• 申請日: 2016-05-16
• 公開（公告）號: CN105891387B
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發明（設計）人: 董軍;曹云峰;郭志謀;葛廣波;高鵬;梁鑫淼;房中則;孫曉宇;洪沫;范旭冉
• 申請（專利權）人: 遼寧潤生康泰生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/08
• 分類號: G01N30/08;G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 大連星海專利事務所有限公司21208
• 代理人: 楊翠翠

技術領域

本發明涉及一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法，其屬于分析化學檢測的前處理技術領域。

技術背景

目前發現的數百種天然氨基酸，按照側鏈基團的不同可分為親水性氨基酸和疏水性氨基酸，通常共同存在于各種樣品當中。生物體中液體多以水為載體，雞蛋、蜂蜜、血漿、馬鈴薯等樣品在提取后會含有大量的極性物質，其中游離氨基酸含量也多以親水性氨基酸為主。如20種蛋白質氨基酸中，其中12種為親水性氨基酸，其余8種為疏水性氨基酸。人體中的半必需氨基酸半胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、絲氨酸、甘氨酸均屬于親水性氨基酸，任何一種的缺失都會造成人體代謝的紊亂。親水性氨基酸在生物體內代謝可發揮一些特殊的作用，如谷氨酰胺和天冬酰胺是兩個影響動物細胞大規模培養過程效率的關鍵營養物，對細胞生長、抗體表達和氨的生成有顯著影響。在常規以液相反相色譜分離為主檢測當中，極性物質和親水性氨基酸往往同時在保留時間一起出峰，給后續親水性氨基酸的檢測造成很大的麻煩。鑒于當前有關親水性氨基酸的制備方法及標準較少，造成目前多見于各種樣品中氨基酸的提取制備存在著親水性氨基酸回收率低，親水性氨基酸檢測數目較少等現象，迫切需要一種制備方法用于親水性氨基酸的分離分析檢測。

發明內容

本發明涉及一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法，原理是依靠硅膠表面極性基團鍵合相填料表面對樣品中親水性氨基酸的強烈吸附作用。樣品中的親水性氨基酸在填料上先被保留下來，通過優化富集制備過程中溶劑含量及淋洗配比等參數，除去一些生物基質，之后采用特定配比的洗脫液將親水性氨基酸選擇性的洗脫出來，實現樣品中親水性氨基酸的富集制備。

一種用于檢測親水性氨基酸的富集方法，包括以下步驟：

（1）樣品提取

將樣品置于離心管底部，加入提取液渦旋提??；渦旋混合30秒后，再超聲3min，15000g/min離心5min后取全部上清液備用；

所述提取液為有機溶劑與100mM緩沖鹽溶液按體積比70-90:10-30混合的混合溶液；

（2）裝填固相萃取柱

裝填規格為30-100mg/1mL或者100-500mg/5mL的固相萃取柱；填料為硅膠表面極性基團鍵合相填料，所述極性基團為羥基、羧基、氨基、酰氨基、氰基中的一種或多種；鍵合相填料的粒徑為5-100 um，孔徑60-300 nm，比表面積50-800 m²/g；

（3）富集親水性氨基酸樣品

先采用體積比有機溶劑∶100mM緩沖鹽溶液：水=10:25:65的第一混合液對固相萃取柱進行活化；再加入體積比有機溶劑∶100mM緩沖鹽溶液：水=90: 5: 5的第二混合液進行平衡；將全部上清液樣品上樣后，加入第二混合液進行淋洗；最后用體積比有機溶劑∶100mM緩沖鹽溶液：水：酸=70:5:24:1的第三混合液進行洗脫，并收集全部的洗脫餾分，并將餾分濃縮至干后重溶于100uL 0.1moL/L的鹽酸中；

所述提取液、第一混合液、第二混合液、第三混合液中有機溶劑及緩沖鹽溶液是相對應的，所述有機溶劑為甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一種或多種，所述緩沖鹽溶液為甲酸銨和/或乙酸銨的甲酸和/或乙酸溶液，緩沖鹽溶液的pH為1-4。

所述水性氨基酸為L-脯氨酸、4-羥基-L-脯氨酸、L-O-磷酸絲氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷胱甘肽、L-瓜氨酸、L-精氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-蘇氨酸-3-磷酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-組氨酸、S-磺基-L-半胱氨酸、半胱亞磺酸、肌肽、甘氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、亞磺酸中一種或多種。

所述上清液中樣品質量占固相萃取柱中填料質量的0.5%-10%。

富集制備采用的過程方法，具體步驟如下：

1) 配置樣品提取試劑。提取液為有機溶劑∶100mM緩沖鹽溶液，其中有機溶劑和鹽兩者體積比介于70∶30—90∶10之間。有機溶劑為甲醇，乙醇，乙腈，丙酮中的任意一種或多種組合；所采用的緩沖液為甲酸銨或乙酸銨中的一種或兩者組合，調劑緩沖鹽用的酸為甲酸或乙酸中的一種或兩者組合；PH介于1-4之間；

2) 樣品提取。

A，液體樣品處理：移取100uL樣品到1.5mLEP管底部，加入900uL提取液渦旋提取。渦旋混合30秒后，再超聲3min，15000g/min離心5min后取全部上清液備用；