[發明專利]一種分離純化替考拉寧的方法

有效

• 申請號: 201610319265.7
• 申請日: 2016-05-13
• 公開（公告）號: CN107365358B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 張貴民;朱海洋;李春利
• 申請（專利權）人: 魯南新時代生物技術有限公司
• 主分類號: C07K9/00
• 分類號: C07K9/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16
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1.一種分離純化替考拉寧的方法，其特征在于它依次包括如下步驟：

1)陶瓷膜過濾替考拉寧發酵液；

2)大孔吸附樹脂柱層析；

3)陽離子交換樹脂柱吸附、洗脫；

4)洗脫液納濾濃縮；

5)反向層析樹脂柱吸附、洗脫；

6)活性炭脫色；

7)脫色液納濾濃縮；

8)超濾過濾，納濾濃縮；

9)凍干；

其中，步驟1)所述陶瓷膜過濾包括：將替考拉寧發酵液用1mol/L氫氧化鈉溶液調pH至10.5～11.5，控制料液溫度范圍20～40℃，進行陶瓷膜過濾；

步驟2)具體包括：控制上樣流速1～2倍柱體積/小時，上樣結束后先用酒精度10％～20％乙醇溶液沖洗樹脂柱4-5倍柱體積，然后用酒精度80％～90％乙醇溶液洗脫，流出液顏色變深時，開始收集洗脫液，當洗脫液單位低于600mg/L時洗脫結束，根據HPLC檢測結果收集80％～90％乙醇洗脫液；

步驟3)具體包括：上樣流速控制在5～7倍柱體積/小時，上樣結束后用純化水沖洗樹脂柱,然后用0.2～0.5mol/L乙酸溶液洗脫，洗脫液單位約1000mg/L時開始收集，0.2～0.5mol/L乙酸繼續沖洗，收集洗脫液，直到洗脫液單位低于200mg/L時，結束收集；

步驟5)包括：用純化水將步驟4)收集的濃縮液稀釋，用乙酸調pH值至2.3～3.5作為待上樣液，上樣，上樣流速2～3倍柱體積/小時，上樣結束后，用丙酮水溶液沖洗樹脂柱3～5倍柱體積，所述丙酮水溶液中，以V/V計，丙酮：水＝1:4～9，含乙酸銨2～3g/L，pH值3～4；然后用丙酮水溶液進行洗脫，所述丙酮水溶液中，以V/V計，丙酮：水＝1:3～4，含乙酸銨2～3g/L，pH值3～4；每約0.1倍柱體積收集于一個容器，洗脫液單位低于100mg/L時，結束收集，用HPLC檢測收集液，根據檢測結果進行合并。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述大孔吸附樹脂柱的樹脂型號為HZ818或XAD16，樹脂柱徑高比1:3～4。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述陽離子交換層析的樹脂型號D113，樹脂柱徑高比1:1～21。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)具體包括將步驟3)收集的洗脫液過納濾膜進行濃縮，控制溫度在20～40℃，濃縮至單位20～30g/L時，用純化水流加入納濾濃縮液中，繼續濃縮，以除去其中的乙酸。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)所述反向層析樹脂柱為SKP樹脂柱，樹脂柱徑高比為1:1～2。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟6)所述活性炭脫色，向替考拉寧洗脫液中加入活性炭，其中替考拉寧與活性炭重量比為1:0.5～1，攪拌0.5～1小時，將活性炭濾除，收集脫色清液。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟7)所述步驟包括將6)收集的脫色液過納濾膜進行濃縮，控制溫度在20～40℃，濃縮至單位20～30g/L時，用純化水流加入納濾濃縮液中，繼續濃縮，以除去其中的乙酸銨和丙酮。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟8)取上步濃縮液加入2～3倍注射用水進行稀釋，用0.5mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至6.5～7.0，超濾膜其截留分子量為10kDa過濾，收集透過液，然后用注射用水洗滌剩余液，收集透過液，直至剩余液中替考拉寧全部透過為止；將超濾透過液用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.5～7.0，進行納濾濃縮，直到濃縮液中替考拉寧濃度在50～80g/L時，結束濃縮。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟9)包括：先在-80℃～-60℃壓力低于20Pa的條件下冷凍2～8小時；然后在-60℃～20℃，壓力為20～60Pa條件下凍干50～80小時；最后在20℃～30℃，壓力低于10Pa的條件下凍干4～10小時。