[發明專利]軟棗獼猴桃L-半乳糖內酯脫氫酶基因及其表達方法

在審

• 申請號: 201610318068.3
• 申請日: 2016-05-13
• 公開（公告）號: CN105755018A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 張慶田;范書田;楊義明;李曉艷;艾軍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/11;C12N15/10;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/66;C12R1/19
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 李進

1.一種自軟棗獼猴桃提取的L-半乳糖內酯脫氫酶基因，其特征在于，所述L-半乳糖內酯脫氫酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

2.權利要求1所述的軟棗獼猴桃L-半乳糖內酯脫氫酶基因編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

3.擴增權利要求1所述軟棗獼猴桃L-半乳糖內酯脫氫酶基因的引物對，其特征在于，所述引物對的上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。

4.權利要求1所述的軟棗獼猴桃L-半乳糖內酯脫氫酶基因的克隆方法，其特征在于，包括：

1)、提取軟棗獼猴桃總RNA，以此為模板進行反轉錄得到第一鏈cDNA；

2)、根據Genbank中已登錄的植物L-半乳糖內酯脫氫酶基因保守序列設計引物，以所述第一鏈cDNA為模板進行PCR擴增，將所得擴增產物測序得到軟棗獼猴桃L-半乳糖內酯脫氫酶基因保守區序列；

3)、根據所述軟棗獼猴桃L-半乳糖內酯脫氫酶基因保守區序列設計3'-RACE引物和5'-RACE引物，以軟棗獼猴桃總DNA為模板，利用cDNA末端快速擴增技術進行擴增，將擴增產物測序后通過生物信息學方法分析并去除載體序列，將5'-RACE和3'-RACE測序結果拼接獲得cDNA全長；

4)、通過生物信息學方法對獲得的軟棗獼猴桃L-半乳糖內酯脫氫酶全長cDNA序列進行開放閱讀框分析從而得到目的基因所編碼蛋白質的氨基酸序列。

5.含有權利要求1所述基因的重組質粒。

6.如權利要求5所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒為將SEQIDNo:1所示的核苷酸插入到pMD18-T、pEASY或pET-28a(+)中得到。

7.權利要求6所述的重組質粒的構建方法，其特征在于：

將SEQIDNO:1所示的基因片段連接到克隆載體pEASY上，得到pEASY-Gal；

對pEASY-Gal進行擴增；

將SEQIDNO:1所示基因片段從pEASY-Gal上酶切下來，連接到經過相同限制性內切酶切割的表達載體pET-28a(+)上，構建獲得的重組質粒即為L-半乳糖內酯脫氫酶表達載體。

8.含有權利要求5或6所述重組質粒的宿主細胞。

9.如權利要求8所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為JM109或BL21(DE3)-T1^R中的一種。

10.權利要求6所述的重組質粒在BL21(DE3)-T1^R細胞中表達制備重組蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將連接有SEQIDNo:1所示核苷酸序列的表達載體pET-28a(+)轉入BL21(DE3)-T1^R細胞，使用含卡那霉素的LB培養基、36～38℃培養至OD600nm值為0.5～0.7后添加IPTG誘導；繼續36～38℃培養表達重組蛋白；將表達后的蛋白經初步分離、純化后制得重組蛋白。