[發明專利]自動快速判別熒光定量PCR結果的方法

在審

• 申請號: 201610316703.4
• 申請日: 2016-05-13
• 公開（公告）號: CN105755159A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 趙國棟;馬勇;鄭岷雪
• 申請（專利權）人: 蘇州國科聞普生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

技術領域

本發明屬于生物學分析領域，特別涉及一種自動快速判別熒光定量PCR結果的方法。

背景技術

熒光定量PCR(PCR：聚合酶鏈式反應)是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程的定量實驗技術。熒光定量PCR的數據分析流程一般為：

(1)基線的設置:通常情況下，選擇自動化分析，此時機器會針對每條曲線進行優化分析，因此效果通常比較好。在基線自動分析的基礎上如出現某些形狀異常的曲線，則需要手動調整基線分析。

(2)閾值設置：閾值也可以自動設置或人工設置，擴增曲線與閾值的交點，對應的就是閾值循環數，亦被稱為Ct值(Cyclethreshold)，通過對Ct值分析即可得到樣本的濃度信息。

然而在實際的數據分析過程中，因為邊緣效應、樣本處理不干凈等因素，一些擴增曲線的形狀異常，所得到的Ct值不可信，無法進行后續的分析。在需要使用同一PCR反應體系(包括反應混合物配方、熱循環條件、儀器設備和數據分析條件，如基線設置和Ct閾值等)對大量同類實驗對象進行檢測的情況下，通過手動去逐個確認曲線是否正常會耗費大量的時間而大大降低實驗效率。特別是將熒光定量PCR應用于臨床分子診斷時，一般是直接通過Ct值給出臨床報告，如果不通過直接觀察擴增曲線去剔除異常曲線，可能存在的異常曲線將會造成臨床檢驗結果的不可信，甚至造成誤診或漏診的嚴重后果。因此，開發一種可以快速自動識別熒光定量PCR異常擴增曲線的方法在熒光定量PCR實際應用中具有很好的實際意義。

發明內容

針對現有技術存在的不足，本案的目的是提出一種自動快速判別熒光定量PCR結果的方法，來提高熒光定量PCR數據分析效率和數據準確性。

為實現上述目的，本案通過以下技術方案實現：

一種自動快速判別熒光定量PCR結果的方法，其包括：

提取熒光定量PCR的數據曲線；

對數據曲線進行基線設置；

設立一個熒光強度的標準閾值，其所對應的循環數為Ct1，所述標準閾值設置在數據曲線的指數上升期；

設立一個熒光強度的輔助閾值，其所對應的循環數為Ct2，所述輔助閾值設置在數據曲線的指數上升期，且所述標準閾值≠所述輔助閾值；

建立一個評分公式z進行分值計算，所述評分公式z＝(Ct1-Ct2)/(log(標準閾值，2)-log(輔助閾值，2))；

當0＜z＜(1/E)+1時，則判定數據曲線為正常曲線，否則為異常曲線；

其中，E為熒光定量PCR效率值。

優選的是，所述的自動快速判別熒光定量PCR結果的方法，其中，還包括：

設立一個臨界Ct值；

若0＜z＜(1/E)+1，且臨界Ct值＞Ct1，則判定數據曲線為陽性曲線；

若0＜z＜(1/E)+1，且臨界Ct值≤Ct1，則判定數據曲線為陰性曲線。

優選的是，所述的自動快速判別熒光定量PCR結果的方法，其中，所述標準閾值是所述輔助閾值的不等于1的任何倍數。

優選的是，所述的自動快速判別熒光定量PCR結果的方法，其中，所述標準閾值是所述輔助閾值的2-10倍。

優選的是，所述的自動快速判別熒光定量PCR結果的方法，其中，E＝10^1/k-1，其中，k為熒光定量PCR標準曲線的斜率。

本發明的有益效果是：本案通過設計了一種全新的識別方法，使得可以快速、準確地判別熒光定量PCR測試數據，提高對檢測數據的判斷速度和準確率，相較于傳統的只讀取Ct值的方法，此法能夠極大地提高對數據的識別能力，有效甄選出異常曲線，顯著降低了熒光定量PCR數據的假陽性率。(見表2)

附圖說明

圖1為熒光定量PCR測試數據的曲線圖。其中，縱坐標為熒光強度，橫坐標為循環數。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。

本案列出一實施例的自動快速判別熒光定量PCR結果的方法，其包括：

提取熒光定量PCR的數據曲線；

對數據曲線進行基線設置；

設立一個熒光強度的標準閾值，其所對應的循環數為Ct1，標準閾值設置在數據曲線的指數上升期；

設立一個熒光強度的輔助閾值，其所對應的循環數為Ct2，輔助閾值設置在數據曲線的指數上升期，且標準閾值≠輔助閾值；