[發明專利]一種柑橘衰退病的q-PCR引物

在審

• 申請號: 201610316545.2
• 申請日: 2016-05-12
• 公開（公告）號: CN105755178A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 戴素明;李芳;鄧子牛;李大志;程鵬
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所 43205
• 代理人: 張慧;趙靜華

技術領域

本發明涉及一種柑橘衰退病毒檢測引物，具體涉及一種用于q-PCR檢測柑橘衰退病毒的p23基因引物序列，屬于生物技術領域。

背景技術

柑橘衰退病是一種世界性的柑橘病害，對柑橘產業危害嚴重。果樹感染柑橘衰退病后，出現樹勢衰退、矮化、生長緩慢、果實品質和產量低或者無果等癥狀。目前，生產中該病害防控主要依賴無病毒苗木種植。為保證苗木的無毒化，在生產過程中需要對柑橘衰退病進行檢測。

在病毒病的檢測中，q-PCR是一種常用的方法，具有靈敏度高、快速、準確的優勢。然而，這些優勢往往受到引物擴增效率的限制。雖然已有報道，利用ORF1，p25，p20和3’UTR基因設計的引物序列可對病毒進行檢測，但是這些引物很難檢測到低含量的病毒。因此，必須篩選一種高效率的柑橘衰退病毒檢測引物。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術的不足，提供一種靈敏度較高的柑橘衰退病的q-PCR引物，通過q-PCR可以檢測不同基因型的柑橘衰退病毒。

本發明解決其技術問題采用的技術方案是，一種柑橘衰退病的q-PCR引物，序列如下：上游引物p23-F：CGTGGATTGYGGTAGAAA，下游引物p23-R：CTGAGAYTGYGTATTGTT。

本發明克服現有引物檢測效率低的不足，提供一種柑橘衰退病p23基因的擴增引物，通過q-PCR可以檢測不同基因型的柑橘衰退病毒。

本發明將已公布的柑橘衰退病毒p23基因序列與多個自主分離病毒株系的p23基因序列進行同源分析，在保守區域處進行引物設計，序列為p23-F:5’-CGTGGATTGYGGTAGAAA-3’,R:p23-R:5’-CTGAGAYTGYGTATTGTT-3’，上、下游引物序列均為18bp。

與已報道的引物進行靈敏度比較，本發明之引物，病毒檢測靈敏度，較ORF1和3’UTR基因的擴增引物提高625倍，較p25和p20基因的擴增引物提高5倍。

本發明引物根據NCBI已經公布的柑橘衰退病毒p23基因序列，與自主分離的多個p23基因序列同源比對分析后設計，通用型強，不受柑橘衰退病基因型的限制；檢測靈敏度高(最低可以檢測的濃度是8.2×10^-6ng/μL的cDNA)，可用于低含量病毒的檢測，避免因病毒濃度低而檢測失敗；能夠適合多種柑橘組織檢測，結果穩定，提高柑橘衰退病檢測效率。

附圖說明

圖1為p23引物對不同基因型柑橘衰退病毒的q-PCR擴增結果圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。

實施例1

本實施例是利用感染柑橘衰退病的柑橘葉片總RNA，將總RNA反轉錄后的cDNA稀釋成不同濃度，再進行q-PCR擴增，分析引物的擴增效率。

1)RNA的提取：按照公知的方法提取感染柑橘衰退病的柑橘葉片總RNA；

2)反轉錄：反應體系為：RNA0.5μg，隨機六聚體引物0.5μg，1mMdNTP5μL，M-MLV200U，5×M-MLVbuffer5μL，RNase20U，用RNA-free水補足至25μL。反應程序為：37℃45min，65℃10min。

3)cDNA的稀釋濃度為80ng/μL的cDNA用RNA-free水進行5倍稀釋。

4)RealTimePCR反應反應體系為SYBRMIX(BiO-rad170-8882AP)10μL，上下游引物(10μM)各0.4μL，模板cDNA2μL，ddH₂O7.2μL。反應程序為95℃5min,95℃5sec,55℃15sec,40個循環，在72℃采集熒光信號。

步驟4)中，所述上下游引物采用本發明之上游引物p23-F：CGTGGATTGYGGTAGAAA，下游引物p23-R：CTGAGAYTGYGTATTGTT。

對比例，步驟4)中，所述上下游引物分別采用ORF1，p25，p20和3’UTR基因的引物序列。

ORF1，p25，p20,3’UTR引物序列如下：

ORF15‘-AACGGGGTGACCAAGAC-3’

5‘-AACCGACACAGTTTAGTATAGC-3’

p255‘-AGCRGTTAAGAGTTCATCATTRC-3’

5‘-CRGTCCAAAGTTTGTCAGA-3’

p205‘-TATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’