[發(fā)明專利]一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610313516.0
• 申請(qǐng)日: 2016-05-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105733968B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 齊肇然;殷幼平;王中康;邵長(zhǎng)文;李富寬;董芳;邱奉同
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 齊肇然
• 主分類號(hào): C12N1/14
• 分類號(hào): C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 山東濟(jì)南齊魯科技專利事務(wù)所有限公司37108
• 代理人: 宋永麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及殺蟲(chóng)真菌細(xì)胞領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

萊氏野村菌作為蟲(chóng)生真菌成為生物防治領(lǐng)域理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用的熱點(diǎn)，萊氏野村菌在固體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)兩型生長(zhǎng)現(xiàn)象，即由酵母型細(xì)胞狀態(tài)向菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)換，一方面，萊氏野村菌酵母型細(xì)胞類似蟲(chóng)體內(nèi)的蟲(chóng)菌體，在液體發(fā)酵中產(chǎn)生的芽生孢子生長(zhǎng)迅速，適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)；另一方面，在邵長(zhǎng)文研究開(kāi)發(fā)的ATMT系統(tǒng)中酵母型細(xì)胞作為受體細(xì)胞，因此無(wú)論是工業(yè)生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)室研究，都給萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的培養(yǎng)提出了現(xiàn)實(shí)需求。

目前，萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的獲得方法有兩種：一是用接種器在固體培養(yǎng)基表面劃線制備，這種方法制備量小，對(duì)分生孢子的分散效果不佳，這是由于萊氏野村菌由酵母型細(xì)胞向菌絲型的轉(zhuǎn)換受群體密度和pH的影響，往往只能在劃線的末端區(qū)域會(huì)出現(xiàn)酵母型細(xì)胞菌落，并且隨著萊氏野村菌的生長(zhǎng)，其代謝產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值下降，而培養(yǎng)基pH值的下降至6.5以下時(shí)，酵母型細(xì)胞向菌絲型生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換則越來(lái)越迅速，因此所得的酵母型細(xì)胞的純度不高，在顯微鏡視野內(nèi)有大量菌絲體，需要多次轉(zhuǎn)接純化才能得到高純度的酵母型細(xì)胞；第二種是采用制備分生孢子懸浮液的方法，這種方法雖然孢子的分散效果較好，但是很容易污染，并且酵母型菌落長(zhǎng)出時(shí)邊界不明顯，不便于確定刮取酵母型細(xì)胞的時(shí)間，因此探索獲得大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法亟需研究。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

①將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，加入pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH至6.5~8.5，得到混合液，將所得混合液在120~125℃下滅菌20~30分鐘，然后均勻倒在平板上至2~3毫米的厚度，冷卻后得到培養(yǎng)基；所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸餾水的重量體積比為2~5g：0.8~3g：0.8~3g：0.8~1.5g：90~95ml；所述的pH調(diào)節(jié)劑為氫氧化鈉，氫氧化鉀或pH緩沖劑；

②用滅菌的接種器蘸取萊氏野村菌分生孢子，置于步驟①得到的培養(yǎng)基表面上方5~7厘米處，敲擊接種器，將萊氏野村菌分生孢子均勻撒在步驟①得到的培養(yǎng)基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基的分布密度為0.5~3個(gè)/cm²；

③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基置于溫度24~30℃，濕度為75~90%的光照環(huán)境中，96~168小時(shí)后在培養(yǎng)基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞；

④用滅菌的工具刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞至步驟①所得的培養(yǎng)基表面，用涂布器涂布均勻，置于溫度24~30℃，濕度為75~90%的光照環(huán)境中，24~36小時(shí)后得到7~15倍接種量的高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞。

優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，pH緩沖劑為hepes。

優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，步驟①為將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，加入hepes調(diào)節(jié)pH至7.5，得到混合液，將所得混合液在121℃下滅菌25分鐘，然后均勻倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷卻后得到培養(yǎng)基；所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸餾水的重量體積比為4g：1g：1g：1g：93ml。

優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，接種器為接種環(huán)、接種針或玻璃棒。

優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，涂布器為不銹鋼筷子或頂端燒圓的玻璃棒。

優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，工具為方嘴平頭鑷子。

優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，步驟②中萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基的分布密度為2個(gè)/cm²。

優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基置于溫度26℃，濕度為80%的光照環(huán)境中，96小時(shí)后在培養(yǎng)基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞。

進(jìn)一步優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，包括以下步驟：