[發明專利]一種東南亞型α地貧膠體金快速檢測試紙及其試劑盒

在審

• 申請號: 201610307369.6
• 申請日: 2016-05-10
• 公開（公告）號: CN107356763A
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發明（設計）人: 康可人;陳飛;王繼華
• 申請（專利權）人: 廣州萬孚生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及快速診斷領域，具體涉及一種東南亞型α地貧膠體金快速檢測試紙及其試劑盒。

背景技術

地貧是世界上發病率最高的人類單基因遺傳病之一，屬于常染色體隱性遺傳疾病，其中α地貧主要集中在東南亞，中國南方和少數非洲地區。α地貧中的東南亞型α地貧(α缺失型地貧)大部分是無癥狀基因攜帶者，但相互婚配子代就會出現Bart’s水腫胎和HbH病，是造成潛在危害的主要類型，所以在人群中大規模篩查α缺失型地貧基因攜帶者是預防重癥α地貧出現的重要方法。目前基因檢測是診斷α缺失型地貧最可靠的方法，但其費用高昂，操作繁瑣，需要依靠專業實驗室才能完成檢測。α 缺失型地貧由于缺失位于編碼血紅蛋白的α珠蛋白基因簇，從而影響了α鏈蛋白的正常表達，因此攜帶者及患者(Bart’s水腫胎和HbH病)體內可以代償性產生特征性血紅蛋白ζ蛋白，即ζ蛋白是α缺失型地貧基因攜帶者標志性蛋白。本發明通過制備ζ蛋白的特異性單克隆抗體，并結合膠體金標記技術制備出一種東南亞型α地貧膠體金快速檢測試紙，以及一種包含了所述的東南亞型α地貧膠體金快速檢測試紙的操作便捷的檢測試劑盒，用于對α缺失型地貧基因攜帶者進行免疫學篩查，本發明制備得到的α缺失型地貧膠體金快速診斷試紙及其試劑盒，使用方法簡單，成本低廉，可以有效的定性檢測出存在α基因缺失型地貧攜帶者。

發明內容

本發明公開了一種東南亞型α地貧膠體金快速檢測試紙，包括底板和固定在底板上的依次搭接的樣品墊、結合墊、反應膜和吸水墊，所述的結合墊上涂覆有膠體金標記的ζ蛋白單克隆抗體和抗兔IgG，所述的反應膜上間隔設置有檢測區和質控區，所述檢測區包被有ζ蛋白單克隆抗體，濃度0.5~0.8mg/ml，所述質控區包被有抗兔IgG，濃度0.8~1.2mg/ml。

所述底板優選裁切平整的PVC薄板，厚度0.2~0.4 mm，長7.0 cm，寬4mm。

所述的樣品墊優選玻璃纖維膜。

所述的結合墊優選玻璃纖維膜。

所述的反應膜優選硝酸纖維素膜。

所述的ζ蛋白單克隆抗體由以下步驟制備得到：

(1) 制備ζ蛋白抗原：

a)通過GenBank查獲ζ蛋白的序列，根據ζ蛋白序列設計并合成引物；

b)取誘導后的K562細胞，提取RNA，反轉錄，進行PCR引物擴增；

c)回收PCR擴增產物并與載體pUCm-T連接，通過藍白斑篩選陽性克隆，進行PCR引物擴增獲得ζ蛋白陽性重組質粒；

d)將步驟c)獲得的ζ蛋白陽性重組質粒進行表達、純化及鑒定；

(2) 制備ζ蛋白單克隆抗體：

e)用步驟（1）制備得到的純化的重組ζ蛋白作為免疫原對小白鼠進行免疫；

f)取免疫小白鼠的脾細胞進行細胞融合，經HAT培訓基培養，以ELISA法篩選出ζ蛋白陽性單克隆抗體；

g)經有效稀釋法篩選出能穩定分泌抗人ζ蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，制備ζ蛋白單克隆抗體的腹水，純化腹水得到抗人ζ蛋白單克隆抗體。

所述引物為P1：5'-CG GGATCCGCA GCT GCC CAC CCT GCC GCC A3'(下劃線為BamH I酶切位點)，和引物P2：5'-CG GAATrGGG GGT CCC CGG AGG CGG CGC T3' (下劃線為EcoR I酶切位點)。

所述的膠體金標記的ζ蛋白單克隆抗體由以下方法步驟制備得到：

(1) 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液:

將100ml質量百分含量為0.01%的氯金酸溶液加熱至沸騰后，迅速加入質量百分比微1%的檸檬酸三鈉溶液1.4ml，待顏色穩定后繼續煮沸10min，冷卻并于4℃下保存備用。

(2) 確定膠體金最合適的蛋白標記量：

采用梯度試驗法確定膠體金最小蛋白標記量，用1%碳酸鉀調節膠體金溶液pH值至8.2~9.2范圍內，取若干離心管標序，依序加入不同量的ζ蛋白，并使其用量梯度變化，混勻靜置2小時，加入10%NaCl溶液100μl，顏色不變管的蛋白量即為最小蛋白穩定量，此最小蛋白穩定量的1.2倍，即為最合適的蛋白標記量。

(3) 確定膠體金溶液最佳pH值：