[發(fā)明專利]一種鐵皮石斛細胞規(guī)模培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610305801.8
• 申請日: 2016-05-10
• 公開（公告）號: CN107354124A
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張杰
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州天成新農(nóng)生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N5/02
• 代理公司: 南京艾普利德知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)32297
• 代理人: 陸明耀

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物組織工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種植物生物技術(shù)克隆工程，特別是針對像鐵皮石斛這種藥用價值很高卻生長緩慢、產(chǎn)量極低、對環(huán)境條件要求十分苛刻的瀕危物種，以及對土地破壞比較嚴重，例如甘草等植物。

背景技術(shù)

隨著城市化進程的迅速發(fā)展和人口的不斷增長，生態(tài)環(huán)境的不斷退化，使許多名貴中藥材資源枯竭和瀕滅。特別是針對像鐵皮石斛這種藥用價值很高卻生長緩慢、產(chǎn)量極低、對環(huán)境條件要求十分苛刻的瀕危物種，其社會效益很大。另一方面，由污染導(dǎo)致的食品安全問題已非常嚴重，農(nóng)藥殘留和重金屬超標是中草藥植物的一大問題，也亟需解決。

鐵皮石斛，顧名思義，是專指生于巖石上的石斛。至于附生于樹木上的石斛屬植物，古代本草亦有記載，稱之為木斛?！侗静萁?jīng)集注》曰：“生櫟樹上者名木斛，其莖形長大而色淺?！袷及惨喑瞿觉?，至虛長，不入丸散”。《本草圖經(jīng)》曰：“惟生石上者勝。亦有生櫟木上者，名木斛，不堪用?！蹦壳皬V泛培養(yǎng)于木屑之上的木斛，藥性甚微，而且大面積占用土地。雖然從上個世紀80年代開始，人們試圖用種子繁殖，人工栽培等手段或通過組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)種子原莖球來擴增植株，再進行人工引種栽培等方法，擴大鐵皮石斛的生產(chǎn)。該方法目前已經(jīng)比較成熟，但由于種植者對醫(yī)書中描述的鐵皮石斛種植方式的了解不夠，絕大部分種植者都種植木斛，其藥用價值大打折扣，而且利用有性繁殖產(chǎn)生種子，經(jīng)發(fā)芽擴增的方法很容易造成變種，對石斛物種的純度造成很大的威脅。

本發(fā)明根據(jù)高等植物細胞的兩個全能性：植物細胞具有分化成完整植株的全能性和植物細胞能合成原生植株藥用有效成份的全能性。針對鐵皮石斛這一具體物種，發(fā)明了一整套從鐵皮石斛原生植株成株莖段休眠芽上直接誘導(dǎo)出愈傷組織，直接用愈傷組織或用誘導(dǎo)出的鐵皮石斛胚狀體進行單細胞懸液制備，再利用組織工程技術(shù)對該細胞進行懸浮式的工業(yè)化大規(guī)模擴增，進而將該方法與人工光源相結(jié)合，利用控制溫度、酸堿度、氧含量、以及生長調(diào)節(jié)劑比例等將生產(chǎn)規(guī)模擴大到噸級以上的規(guī)模。

利用本發(fā)明的鐵皮石斛懸浮細胞規(guī)模培養(yǎng)工藝，其生長速率達到9-12毫克/克·天；相當(dāng)于自然生長速度的1000倍以上。利用規(guī)?；囵B(yǎng)基礎(chǔ)罐(50升)每20-30天產(chǎn)量可達2公斤干品，擴增產(chǎn)能每罐得率均在2.5％以上，得干率lO％以上。通過實施本發(fā)明的技術(shù)工藝，使鐵皮石斛的生物培養(yǎng)規(guī)模從土地種植的低水平向工廠化生產(chǎn)規(guī)模轉(zhuǎn)化。同時，由于生產(chǎn)流程得到了良好的控制，使農(nóng)殘重金屬幾乎檢測不到，大大提高了產(chǎn)品長期服用的安全性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為一種體外規(guī)模化懸浮培養(yǎng)擴增石斛胚狀體方法，其培養(yǎng)過程是：石斛帶休眠芽莖段，插入到適宜固體培養(yǎng)基上，在合適的培養(yǎng)溫度和光照強度下，待愈傷組織長出后，將愈傷組織剝離，置于相同的上述培養(yǎng)基上擴增，擴增后將愈傷組織進行勻漿酶解、研磨或噴霧等理化手段分解為單細胞懸液，置于搖床上以90-120轉(zhuǎn)/分進行震蕩懸浮培養(yǎng)，每瓶按適當(dāng)接種率接種，根據(jù)生長情況繼代；

經(jīng)數(shù)次繼代適應(yīng)懸浮培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入大規(guī)模生物反應(yīng)器中進行連續(xù)擴增，通過調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器中的指標、更換培養(yǎng)基成分、改變生長調(diào)節(jié)劑比例、以及分批在線收集等手段，最終達到 每25-50天收獲一次或連續(xù)、半連續(xù)培養(yǎng)，多糖含量達到15％以上，比生物生長速率達8-9.5毫克/克·天，并保持20L至噸級單元生產(chǎn)規(guī)模、常年穩(wěn)定的擴增體系。

具體的操作為：

石斛帶休眠芽莖段，插入到適宜固體培養(yǎng)基上，在合適的培養(yǎng)溫度和光照強度下，待起始胚狀體長出后，將胚狀體剝離，或待愈傷組織形成后直接剝離愈傷組織，經(jīng)勻漿酶解、研磨或噴霧等理化手段分解為單細胞懸液，置于相同的上述培養(yǎng)基上擴增，擴增后轉(zhuǎn)入到上述培養(yǎng)基去掉瓊脂粉的液體培養(yǎng)基中，置于搖床上90-120轉(zhuǎn)/分振蕩懸浮培養(yǎng)，獲得細胞種子；將細胞種子按一定接種比例接種到生物反應(yīng)器中，通過調(diào)節(jié)氧含量在30-50％之間，pH為5-7，固定光源光照12-20h，光照強度2000-8000Lx，培養(yǎng)分階段進行，每一階段為10-15天，不同階段的光質(zhì)交替變換，所述的光質(zhì)為紅藍光，所述的交替變換為紅藍光比例由第一階段的2-3:4-5調(diào)整為第二階段的3-4:4-6，再由第二階段的3-4:4-6調(diào)整為第三階段的2-3:4-5，并以此模式循環(huán)；每階段更換新鮮液體培養(yǎng)基一次。每15-25天收獲石斛胚狀體培養(yǎng)物的30-50％，并補充相應(yīng)比例的新鮮液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)持續(xù)進行；所述液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)劑，植物生長調(diào)節(jié)劑為生長素、細胞分裂素的組合或生長素、細胞分裂素與ABA的組合，總濃度為在0.05-5mg/L調(diào)整。