[發明專利]一株高產甲醇蛋白的畢赤酵母菌株及應用

有效

• 申請號: 201610305121.6
• 申請日: 2016-05-10
• 公開（公告）號: CN105779317B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 姜岷;董維亮;馬江鋒;章文明;戴仲雪;吳若凡
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N1/02;C12P21/00;C12Q1/6869;C12Q1/04;C12R1/84
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

本發明涉及一株高產甲醇蛋白的畢赤酵母菌株Pichia sp.MP?1及其在單細胞甲醇蛋白制備過程中的應用，該菌株可以同化多種糖類及常見氮源化合物，能發酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和半乳糖，根據生理生化特性及26S rDNA序列將其鑒定為畢赤酵母屬，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC NO：M 2016172。利用本發明的甲醇營養型菌株和工藝能夠實現高密度發酵，最終菌體濕重達到350?400 g/L，甲醇蛋白干重達到110?120 g/L，蛋白質含量達到65%，甲醇蛋白單耗甲醇比在1.9?2.2:1，本發明對動物飼料蛋白添加劑的發展具有重大的現實意義和經濟價值。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，特別是一株高產甲醇蛋白的畢赤酵母菌株及其在甲醇蛋白制備過程中的應用。

背景技術

甲醇蛋白是以甲醇為碳源生產的單細胞蛋白，以甲醇、氨、硫酸和磷酸等為原料作為培養基，通過微生物發酵在甲醇基體中生長、消耗甲醇，生長成許多單細胞菌體，成為菌體單細胞蛋白，簡稱SCP。甲醇蛋白的主要成分為粗蛋白、脂肪、賴氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、礦物質和維生素，其中，粗蛋白質量分數平均在70%以上。甲醇蛋白被成為第二代單細胞蛋白，營養價值高，其粗蛋白含量比魚粉和大豆等飼料高得多。因此，國外已將甲醇蛋白廣泛應用于仔豬、肉雞、小牛和魚的飼料，目前正在研究將甲醇蛋白用作人類食品的蛋白質添加劑和調味品原料。

我國蛋白飼料供需缺口每年達幾千萬噸，隨著人民生活水平的提高及養殖業的快速發展，飼料蛋白的供需矛盾進一步加劇。基于這種原料短缺的嚴重形勢，必須盡快改變我國蛋白質飼料嚴重緊缺的國情，維護我國農業的基礎地位。單細胞甲醇蛋白中的粗蛋白可替代植物蛋白用于飼料行業，是一個十分重要且極具發展前景的產品。目前，甲醇蛋白生產中存在菌種單一，發酵工藝陳舊，成本高而效率低等難題。如能分離蛋白質含量較高、必須氨基酸組成協調的甲醇營養型菌株，可以降低原料消耗，節約能源使用，提高甲醇蛋白營養價值。

發明內容

本發明的目的是針對單細胞甲醇蛋白的制備，提供一株甲醇營養型菌株，該菌株能夠高產甲醇蛋白。

本發明的另一目的是構建含有該甲醇營養型菌株26S rDNA序列的克隆載體以及含有該載體的工程菌株，在分子水平上對該甲醇營養型菌株進行鑒定。

本發明的又一目的是提供該甲醇營養型菌株在單細胞甲醇蛋白制備過程中的應用。

所述甲醇營養型菌株為畢赤酵母，其分類命名為Pichia sp. MP-1，已保藏于中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC），保藏編號為：CCTCC NO：M 2016172，保藏日期為：2016年4月5日，保藏地址為：中國. 武漢. 武漢大學。

本發明所述的Pichia sp. MP-1篩選方法：用含有微量元素溶液的無機鹽培養基，調整pH值至4.8-5.0，以甲醇作為唯一碳源，對葡萄自然發酵過程中的甲醇營養型菌株進行分離純化。

具體地，以葡萄自然發酵菌群作為篩選目標，利用1%甲醇的無機鹽培養基作為介質，連續富集培養甲醇營養型菌株，將富集培養基稀釋涂布至含有1%甲醇的無機鹽固體培養基，30℃培養2 d，挑去形態不同的甲醇營養型菌株進行劃線培養獲得純培養，命名為Pichia sp. MP-1，再次驗證純種微生物Pichia sp. MP-1在無機鹽培養基中的甲醇利用能力，利用氣相色譜檢測甲醇含量。

具體地，所述的無機鹽培養基是由85%磷酸26.7 mL、二水合硫酸鈣0.93 g、硫酸鉀18.4 g、硫酸亞鐵0.38 g，七水合硫酸鎂7.12 g、氫氧化鉀4.13 g 加水至1.0 L配制，用氨水調pH值至4.8-5.0，瓊脂20.0 g、121℃滅菌20 min，使用前添加1%過濾除菌的甲醇作為碳源；