[發明專利]檢測豬弓形蟲病循環抗原免疫膠體金試紙條及制備方法

在審

• 申請號: 201610303219.8
• 申請日: 2016-05-10
• 公開（公告）號: CN107356762A
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發明（設計）人: 張西臣;楊正濤;寇金華;宮鵬濤;李建華;楊舉;李赫;李棕松;高珺珊
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司22100
• 代理人: 陳宏偉

1.一種檢測豬弓形蟲病循環抗原免疫膠體金試紙條，包括PVC底板、樣品墊、硝酸纖維素膜（NC）、吸水墊和膠體金墊；其特征在于：

抗弓形蟲表面抗原SAG3單克隆抗體Anti-A-SAG3-23包被在NC膜上的檢測線；另一株抗弓形蟲表面抗原SAG3單克隆抗體Anti-A-SAG3-7包被有金標抗體。

2.如權利要求1所說的一種檢測豬弓形蟲病循環抗原免疫膠體金試紙條制備方法，是利用檸檬酸三鈉還原法制備40nm粒徑的膠體金溶液，用膠體金標記Anti-A-SAG3-7制備金標墊，用Anti-A-SAG3-23及羊抗小鼠二抗包被于硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線（T線）和質控線（C線），其中：

所述的抗弓形蟲表面抗原SAG3單克隆抗體Anti-A-SAG3-23的制備：

1）動物免疫

利用純化的SAG3蛋白免疫SPF級BALB/c雌性小鼠；前三次皮下免疫，最后一次腹腔加強免疫，其效價達25600；

2）細胞融合實驗

制備飼養層細胞，無菌取免疫后的小鼠脾細胞與狀態良好的SP2/0細胞，采用PEG法進行融合；雜交瘤細胞的培養及篩選過程中培養基的更換次序為，HAT、HT及1640，三種培養基有過渡的進行替換；

3）陽性雜交瘤細胞的篩選及克隆

用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞，并將其克隆；

4）陽性雜交瘤細胞株的染色體分析

利用濃度為0.1mg/mL的秋水仙素和吉姆薩染色法處理雜交瘤細胞，進行染色體分析，計算染色體數目；

5）單克隆細胞亞型鑒定

應用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對單克隆抗體亞型進行鑒定，Anti-A-SAG3-7Anti-A-SAG3-23的亞型分別為G2a、G2b；

6）腹水的制備

將雜交瘤細胞小鼠腹腔，收集腹水；

7）單克隆抗體的純化

利用正辛酸-飽和硫酸銨法對對腹水中的單抗進行粗純，再用親和層析住進行精純，得到Anti-A-SAG3-7、Anti-A-SAG3-23。