[發明專利]基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標記和定量分析方法

有效

• 申請號: 201610296568.1
• 申請日: 2016-05-06
• 公開（公告）號: CN105866429B
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 田志新;方后琴
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司31225
• 代理人: 褚明偉

技術領域

本發明涉及一種生物分子的定量方法，尤其是涉及一種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標記和定量分析方法，主要涉及與生物質譜相關的系統生物學、蛋白質組學等技術領域。

背景技術

同位素、同重、或近同重標記現已廣泛用于蛋白的定量分析。標記過程中，標記試劑與蛋白質N端氨基、C端羧基、或氨基酸序列上殘基上的官能團中的一個或多個發生反應，生成新的共價官能團。這些新的官能團的電離效率往往較原來的官能團的低，從而導致標記后蛋白質的分析效率較低。

申請人前期在整體蛋白質定性定量分析方面已經做了較多的工作，有較好的基礎。

在定量數據挖掘方面，公布號為CN103389335A的中國專利公布了一種鑒定生物大分子的分析裝置和方法。公布號為CN 104765984A的中國專利公布了一種生物質譜數據庫快速建立與搜索的方法。公布號為CN104359967A的中國專利公布了一種生物質譜重疊同位素輪廓的解析方法。上述專利中公布了同位素輪廓指紋比對算法(isotopic envelope fingerprinting，iEF)，直接在原始數據上進行匹配離子的搜索和蛋白質的鑒定。該算法無需對實驗數據進行“去同位素”預處理，可以節省相應的時間；根據各個離子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相對強度的偏差對理想及非理想實驗數據進行很好的區分，保證蛋白鑒定的可信度；根據已知重疊離子的同位素峰相對強度關系對重疊實驗數據進行有效的解析。基于該算法申請人成功地開發了整體蛋白數據庫搜索引擎ProteinGoggle，在單個標準蛋白(泛素、肌紅蛋白)及整體蛋白質組混合物(組蛋白H4家族翻譯后修飾異構體、大腸桿菌)的定性鑒定中，表現出較高的可信度和較好的應用前景。在定量分析方面，ProteinGoggle有著它內在的和獨特的潛在優勢；一方面基于同位素輪廓及其中每個同位素的指紋比對可以快速精確地搜索同位素或同重標記的定量離子對；另一方面，搜索過程中每個離子中每個同位素峰的實驗強度都被記錄和輸出，可以用來直接計算相對定量比。

在定量標記方面，公布號為CN105137088A的中國專利公布了一種整體蛋白質定量分析方法。公布號為CN105242050A的中國專利公布了一種不同生理或病理條件下整體蛋白質的定量分析方法，該專利對N端氨基進行同重標記，分別標記為-N(CH₂D)₂和-N(¹³CH₃)₂。上述兩份專利均是基于重同位素的定量標記方法。

發明內容

本發明的目的就是為了提供一種標記效率高且標記蛋白電離效率高的整體蛋白質定量方法，本發明的方法可以實現相對或絕對標記定量；同時保證了分析的靈敏度和效率。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

一種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標記和定量分析方法，包括以下步驟：

(1)將兩組不同生理或病理條件的整體蛋白分別作為控制組與疾病組，分別進行賴氨酸ε-氨基及N端氨基全部同重標記，分別標記為-N(C₁₁¹³CH₁₁N⁺OCH₂)₂和-N(C₁₂H₁₁¹⁵N⁺OCH₂)₂，其單個標記后氨基的質量差異為12.6mDa；

(2)同重標記后兩組蛋白按等比例混合進行高分辨質譜和串級質譜分析得到一個數據組；

(3)對數據組進行定性、定量數據庫搜索，得到蛋白質的ID及疾病組每一個蛋白質相對于控制組的相對比例，即疾病條件下所有蛋白的上調或下調情況，上調或下調倍數最大的蛋白即為與該疾病發生、發展相關的蛋白。

優選地，步驟(1)中，控制組蛋白或疾病組蛋白，一組蛋白質用氰基硼氫化鈉和含¹³C的N(3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鎓鹽標記，另一組蛋白質用氰基硼氫化鈉和含¹⁵N的N(3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鎓鹽標記。

N(3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鎓鹽為自帶電荷同位素試劑，合成方法可依照文獻【馬慧敏，等。合成化學，2014,22(2)，230-233】來進行。