[發(fā)明專利]一種用于桑樹植原體基因組的純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610291495.7
• 申請日: 2016-05-05
• 公開（公告）號: CN105734055B
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孔衛(wèi)青;楊金宏
• 申請（專利權(quán)）人: 安康學(xué)院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 西安西達(dá)專利代理有限責(zé)任公司 61202
• 代理人: 劉華

1.一種用于桑樹植原體基因組的純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、樣品處理，利用解剖刀取桑樹感染植原體的病株的枝條的韌皮部1g，放入干凈的研缽中，加入液氮冷凍后研磨均勻；

步驟二、提取基因組DNA，采用1.5ml離心管收集步驟一粉末，并迅速加入500-700ul緩沖液SLX和5-10ul核糖核酸酶A，利用渦旋器混合均勻，于70攝氏度孵育10分鐘后經(jīng)14000轉(zhuǎn)離心5分鐘，仔細(xì)吸取上清液到一個干凈的1.5ml離心管中，加入30-50ul磁珠和300-500ul無水乙醇，混合均勻，利用磁力架吸附磁珠，丟棄上清，并用70-75%的乙醇洗滌,重復(fù)3次后，利用60-100ul緩沖液TE洗脫，完成基因組DNA的提取；

步驟三、利用甲基化結(jié)合蛋白去除桑樹的基因組，首先在1.5ml的離心管中加入100-200ul蛋白A磁珠，置于磁力架吸附5分鐘后，去除上清，加入緩沖液C和無核酸酶的水，無核酸酶的水根據(jù)要求補充至所需總體積，所述的緩沖液C稀釋比例為1:10，加入10-20ul鏈霉親和素標(biāo)記的甲基化結(jié)合蛋白MBD2，22-25攝氏度震蕩孵育10-15分鐘，置于磁力架吸附5-7分鐘，去除上清，再加入10-20ul緩沖液C、15-30ul水和25-50ul與步驟二提取的基因組DNA，25攝氏度震蕩孵育20分鐘，置于磁力架吸附5分鐘，仔細(xì)吸取上清到一個新的1.5ml離心管中，加入2-3倍體積的無水乙醇和10-20ul5M氯化鈉，冷凍2小時后4度14000轉(zhuǎn)離心10分鐘，沉淀用70-75%的乙醇洗滌2次后用80-100ul緩沖液TE溶解，電泳檢測；

步驟四、去除碎片DNA段，步驟三產(chǎn)物利用瓊脂糖電泳，在1.5%的膠濃度，電壓5V/CM，由細(xì)菌噬菌體Bacteriophageλc1857 Sam7 DNA用EcoT14I酶切反應(yīng)后配制而成的λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker為指示，利用玻璃奶吸附的方法回收19329bp以上的DNA，用于下一步驟；

步驟五、基因定量PCR所使用的引物，在2只200ul薄壁管中分別加入雙蒸水，計算后補充總體至100ul、100微摩3端雙硫代修飾的6隨機引物25-30ul、反應(yīng)緩沖液10ul、步驟二和步驟四所得的產(chǎn)物分別10-15ul，于95攝氏度加熱3分鐘，置于冰上20分鐘，然后加入脫氧核糖核苷三磷酸dNTP，10mM，4-5ul，2-3ul的10mg/ml牛血清白蛋白BSA，phi29聚合酶4-5ul，30攝氏度孵育12小時，65攝氏度10分鐘滅活合成酶，處理后濃度為126ng/ul，可以滿足測序或PCR要求，稀釋至500ul分裝冷凍保存?zhèn)溆茫?/p>

其中所用的引物為：

所述的100微摩3端雙硫代修飾的6隨機引物為常用引物，硫代修飾為防止酶對引物的降解；

步驟六、利用CFX Connect ^TM熒光定量系統(tǒng)，使用Power SYBR? Green PCR MasterMix進(jìn)行定量PCR對步驟五所得樣品中的植原體基因組和桑樹基因組進(jìn)行定量分析；

所述的緩沖液SLX為1%的去氫膽酸鈉Sodium deoxycholate，0.5%的亮抑蛋白酶肽Leupeptin，1%的聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100混合溶液；

所述的緩沖液C為25mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸，62.5mM氯化鎂，5mMDTT，50%甘油，0.5M氯化鉀的混合溶液；

所述的反應(yīng)緩沖液為0.5MTris，0.1M氯化鎂，0.1M硫酸銨，0.1M二硫蘇糖醇DTT的混合溶液；

所述的緩沖液TE為10mM的Tris-HCl緩沖液，1mMEDTA的混合溶液。