[發明專利]肝組織HBVcccDNA定量PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201610289719.0
• 申請日: 2016-05-04
• 公開（公告）號: CN105755151A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 陳延平;李春艷;劉志剛
• 申請（專利權）人: 陳延平
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京國智京通知識產權代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

技術領域

本發明主要技術方法為實時熒光定量PCR(Quantitativereal-timePCR，qRT-PCR)，該技術的基本原理是以分子雜交、基因擴增、光電三項為基礎，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號隨著PCR反應的積累來實時監控PCR反應的進程，并通過分析軟件對PCR的反應進行檢測分析的技術。

背景技術

19世紀80年代，Miller等采用DNA電泳及Southern雜交檢測技術，首次證實慢性乙型肝炎患者肝組織內存在一種電泳帶位置為2.0kb的HBVDNA分子，并在電鏡下證實為大小約3.2kb的超螺旋DNA分子，首次發現并報道了HBVcccDNA的存在。此后，學者們不斷進行探索，20世紀90年代，PCR技術開始應用于HBVcccDNA的檢測。Kock等建立了選擇性PCR方法檢測人PBMC中的HBVcccDNA，該方法利用rcDNA結構上存在缺口的特點，設計了跨越缺口的引物，使結構完整的HBVcccDNA得以選擇性擴增；但當rcDNA濃度較高時，高于105copy即可出現非特異的擴增產物，影響了該方法的特異性，也限制了其的進一步應用。Addison等在以上Kock等方法的基礎上通過引入競爭性PCR，初步實現了HBVcccDNA的定量檢測，并將其用于鴨肝組織中HBVcccDNA的檢測，此方法先將PCR產物酶切，再將酶切產物電泳，最后對待測標本進行密度掃描后得出其中HBVcccDNA的相對含量，即該方法未實現對HBVcccDNA的定量檢測。香港學者He等建立了選擇性實時熒光定量PCR方法，對HBVcccDNA進行定量檢測；該方法通過加入熒光探針將普通PCR法的終點檢測變為實時動態檢測，在很大程度上避免了rcDNA的非特異性擴增，但此法對擴增模板未用能降解rcDNA的酶處理，亦影響了其擴增的特異性。盡管學者們不斷改進檢測HBVcccDNA的方法，但特異性和敏感度仍是目前HBVcccDNA檢測技術所面臨的主要問題。同時，先前研究多集中于對細胞模型和動物的

肝臟模型中HBVcccDNA的檢測應用。迄今為止，國內外尚無公認的、較穩定的并得到相關部門正式批準的用于檢測HBVcccDNA試劑盒的問世，因此，建立一種快速、靈敏、特異地檢測肝細胞內HBVcccDNA方法十分必要。

發明內容

鑒于目前技術存在的上述不足，本發明提供肝組織HBVcccDNA定量PCR檢測方法，本發明能實現對肝組織中HBVcccDNA、β-actin進行靈敏，特異的擴增，并通過β-actin的測定，實現HBVcccDNA在肝細胞中的量化，可用于臨床肝組織及肝細胞中HBVcccDNA的檢測及應用。

本發明的采用如下技術方案：

肝組織HBVcccDNA定量PCR檢測方法，包括以下步驟：

提取肝組織中基因組DNA標本；

構建肝組織內參基因β-actin質粒標準品；

以P1.2Ⅱ質粒作為檢測HBVcccDNA的標準品，對標本的HBVcccDNA進行定量PCR擴增。

作為本發明的優選技術方案，所述提取肝組織中基因組DNA標本的步驟包括：

將肝組織磨碎，移入1.5mlEP管中，加200μl緩沖液GA，震蕩至徹底懸浮；

在上述懸浮液中加入20μl蛋白酶K溶液并混勻得到第一混合溶液，其中混勻條件為56℃，3h；

將上述第一混合溶液進行離心后加入200μl緩沖液GB并混勻得到第二混合溶液，其中混勻條件為70℃，10min；

將上述第二混合溶液進行離心后加入200μl無水乙醇震蕩混勻得到第三混合溶液，其中震蕩時間為15sec；

將上述第三混合溶液加入吸附柱CB3中，其中吸附柱放入收集管中；

將吸附柱CB3中溶液在12,000rpm條件下進行離心30sec棄廢液，加入500μl緩沖液GD得到第四混合溶液；

將第四混合溶液在12,000rpm條件下離心30sec后棄廢液，加入600μl的漂洗液PW得到第五混合溶液；

將第五混合溶液在12,000rpm，離心30sec后棄廢液，加入600μl的漂洗液PW并棄廢液，將吸附柱放入收集管中后在12,000rpm條件下，離心2min得到第六混合溶液；

將第六混合溶液棄廢液，吸附柱置于室溫數分鐘后將吸附柱轉入一清潔EP管中，懸空滴加100μl洗脫緩沖液TE，然后室溫放置5min，12,000rpm，離心2min得到洗脫的DNA。