[發明專利]一種用于檢測HBV相關肝細胞癌的生物學標志物及方法

在審

• 申請號: 201610287812.8
• 申請日: 2016-05-04
• 公開（公告）號: CN105755150A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 王凱;趙靜;陶利萍;范玉琛;李風
• 申請（專利權）人: 山東大學齊魯醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 青島高曉專利事務所 37104
• 代理人: 黃曉敏

技術領域

本發明涉及醫學領域，是一種肝細胞癌相關的用于檢測的生物學標志物，具體為一種用于檢測HBV相關肝細胞癌的生物學標志物及方法。

背景技術

HCC是全球第六大常見腫瘤（每年新增749000例），第三死亡率腫瘤（每年死亡692000例）。此外，許多國家的HCC的發生率逐年升高。近年來，盡管HCC的治療上已有諸多改進，但HCC患者的預后以及5年生存率仍舊不甚樂觀（約0-10%）。造成這一現狀的主要原因是缺乏早期診斷和監測的有效手段。許多病人一經診斷已處于疾病的末期，喪失了治療的機會。目前，最為常用的HCC篩查手段是血清AFP和超聲。然而，它們均存在局限性。AFP的靈敏度與特異性并不能有效診斷和監測。而超聲的診斷率則依賴于操作者的專業水平、肝硬化的出現、腫瘤大小以及病人的數據等。肝穿刺是一個確診HCC的有效手段，但是它可能造成針道轉移。因此，發現一個有效的非侵襲性的生物學標志物用于HCC的早期診斷和監測是一個非常迫切的需求。

啟動子的高甲基化可造成抑癌基因沉默是常見的表觀遺傳學調控，它在包括HCC在內的多種腫瘤的致癌過程中發揮重要作用。而且，一些研究發現惡性腫瘤能夠在疾病的早期階段向血液釋放數量可觀的基因DNA，包括甲基化的DNA序列。此外，許多研究也證實細胞游離DNA（cf-DNA）的甲基化狀況與原發腫瘤組織高度一致，這提示我們，血清或血漿的甲基化狀況可能被用作包括檢測和診斷HCC在內的癌癥的一個新型非侵襲性生物學標志物。近年來，HCC患者的血清或者血漿中的諸多基因，譬如p16、p15、GSTP1、RASSF1A與SFRP1均被發現存在異常甲基化，并且可以被用作HCC早期測定和診斷的非侵襲性標志物。

發明內容

為了解決以上的技術問題，本發明提供了一種用于檢測以HBV相關肝細胞癌的生物學標志物，以及利用此生物標志物的肝細胞癌檢測方法，以下是具體技術方案：

一種用于檢測以HBV相關肝細胞癌的生物學標志物，包括胰島素樣生長因子結合蛋白7（IGFBP7）和甲胎蛋白（AFP）。

利用該生物標志物即IGFBP7和AFP來進行的肝細胞癌檢測方法是通過測定標志物IGFIBP7基因啟動子甲基化水平和檢測標志物AFP聯合血清IGFBP7基因啟動子甲基化的靈敏度來進行判斷。

用于檢測血清IGFBP7基因啟動子區甲基化狀態的引物，包括甲基化引物，其中甲基化引物的上游引物核苷酸序列為：

(5'-3')GGTAAAGTCGGGGTAGTAGTCG；

甲基化引物的上游引物核苷酸序列為：

(5'-3')ACAACCGCTCGAATAAATAATACCG。

用于檢測血清IGFBP7基因啟動子區甲基化狀態的探針為taqman探針，其中甲基化引物的探針序列為：

(5'-3')6FAM-CGCTACCGCACACCGAATAACGACTCTTA-BHQ-1。

用于檢測血清IGFBP7基因啟動子區甲基化狀態的試劑盒內包括無核酶水、緩沖液、上下游引物、Taqman探針和亞硫酸鹽修飾后的DNA，其中緩沖液由FastStartTaqDNA聚合酶、反應緩沖液、MgCl₂和三磷酸脫氧核苷酸混合液組成。

越來越多的證據表明DNA甲基化可能被用作HCC的非常有前景的生物學標志物。但是現有技術主要聚焦于腫瘤組織的DNA甲基化的，它具有創傷且不易獲得的缺點。而且，上述研究對DNA啟動子甲基化的診斷價值的探討相對較少。本發明是首次采用定量的方法來檢測HCC患者血清IGFBP7基因甲基化水平。本發明選用Methylight的方法進行甲基化定量檢測。數據顯示HCC患者血清IGFBP7基因甲基化水平顯著高于CHB與HC。而且，存在血管侵襲的HCC患者血清IGFBP7基因甲基化水平明顯高于無血管侵襲HCC患者。這為血清IGFBP7基因甲基化水平與血清AFP水平聯合用于HCC的診斷提供了證據。