[發(fā)明專利]一種蛋白酶及其制備和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610280521.6
• 申請日: 2016-04-28
• 公開（公告）號: CN105754974A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設計）人: 鄭蘭紅;朱美虹;楊康利;梁方方;康道樂
• 申請（專利權）人: 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N15/57;C12N15/70;A61K38/48;A61P29/00
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李素紅

1.一種蛋白酶，其特征在于它的核苷酸序列為SEQIDNO.1，該序列能編碼所述蛋白酶。

2.權利要求1所述蛋白酶的氨基酸序列為SEQIDNO.2。

3.權利要求1所述蛋白酶的制備方法，其特征在于所述方法包括構建原核表達載體，利用超濾和離子交換方法純化重組蛋白，表達載體為PET22b，所用的酶為NcoI和HindIII，其中特異性引物5’-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3’為PCR擴增反應的正向引物，5’-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3’為相應的反向引物，以蛋白酶的DNA為模版，進行PCR擴增反應，獲得帶有酶切位點的目的片段，將目的基因與載體雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉化到感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中，涂布在Amp/LB瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將長出的陽性克隆重組菌培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)離心通過超濾、硫酸銨沉淀、離子交換方法分離純化得到重組蛋白。

4.權利要求1或2所述蛋白酶的制備方法，其特征在于它的具體步驟如下：

1)采用特異的引物對編碼蛋白的基因進行擴增，擴增的同時在引物上設計NcoI和HindIII的酶切位點，引物為：

Forward：5’-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3’

Reverse：5’-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3’

PCR擴增體系為：2×ESTaqMasterMix25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，DNA模板2μL，加FreeWater至50μL；PCR擴增條件為：90～96℃預變性4～7min，902～97℃變性30s，54～60℃退火30s，72～77℃延伸0.9～1.2min，循環(huán)25～35次，最后71～76℃延伸8～12min；

2)用NcoI和HindIII分別雙酶切PET22b質粒和擴增產(chǎn)物，電泳后回收目的產(chǎn)物，然后用T4DNA連接酶16℃過夜連接，將目的基因與載體連接，最后將連接產(chǎn)物轉化到感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中，涂布在Amp/LB瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，獲得重組菌株，其中氨芐濃度為100～122mg/L，瓊脂濃度為1.9～2.3％；

3)將重組菌株接種于滅菌后的初始發(fā)酵液中，在37℃，200～300r/min下，發(fā)酵培養(yǎng)，待培養(yǎng)至OD600＝0.7～1.0時，加入終濃度為0.8～1.2mM的IPTG，30℃，100～300r/min誘導8～10h，得到發(fā)酵菌液，所述的初始發(fā)酵液，以質量分數(shù)計，包括0.9～1.6％的胰蛋白胨，0.8～1.4％的氯化鈉，0.5～0.7％的酵母提取物，余量為水；

將發(fā)酵液離心，取上清，然后使用3kd、50kd的超濾膜截留；接著使用30％～60％的硫酸銨沉淀，將得到的沉淀重溶后透析、除鹽；然后使用陽離子交換色譜，經(jīng)過掛柱、洗脫，得到純化的活性蛋白。

5.權利要求1-4任何一項所述蛋白酶或所述方法制備的蛋白酶的應用，所述應用包括在洗滌工業(yè)、制革工業(yè)和食品工業(yè)中應用。

6.權利要求1-4任何一項所述蛋白酶或所述方法制備的蛋白酶在制備消炎劑中的應用。