[發明專利]一種金龍膽草組織培養方法

有效

• 申請號: 201610279176.4
• 申請日: 2016-04-28
• 公開（公告）號: CN105766657B
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發明（設計）人: 陳惠;王濤;孫蓉;鄭天潤;劉默洋;李成磊;吳琦;劉姍;唐自鐘;何周鳳
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 成都天匯致遠知識產權代理事務所(普通合伙)51264
• 代理人: 韓曉銀

技術領域

本發明屬于植物組織培養領域，具體地說，涉及一種金龍膽草組織培養方法。

背景技術

金龍膽草(Conyza blinii H.Lév.)屬于菊科白酒草屬兩年生草本植物，又稱熊膽草等，生長在海拔2000米左右的疏林地帶，主要分布于四川攀西地區、云南中南部及貴州西部的部分地區。作為藥用植物其表現為性寒、味極苦，有清熱、消炎、解毒、祛淤、消腫等功效，對祛痰、止咳、平喘、急慢性支氣管炎、咽喉炎、支氣管肺炎等有顯著療效。金龍膽草藥材的獲取方式主要依靠采集野生植株，然而野生種金龍膽草散落分布在狹小的區域中，采集困難且數量無法滿足藥材市場及科研的需求。因此，我們需要一種快速繁殖金龍膽草的技術和方法以保證基本的科研和市場需求。

發明內容

有鑒于此，本發明針對上述的問題，提供了一種金龍膽草組織培養方法，解決了現有技術中存在的污染率高、死亡率高、褐化率高、出根率低以及移栽存活率低的問題。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種金龍膽草組織培養方法，包括以下步驟：

1)外植體的選擇與滅菌：采集生長健壯且無病蟲害的新葉作為外植體；將外植體于流水下沖洗30min，瀝干殘留水份，置于冰上放置1h；冰浴結束后放入干凈的大培養皿帶進超凈工作臺用70％酒精浸泡5s-30s，取出后立即用大量無菌水沖洗3-5遍，然后放入0.1％HgCl₂浸泡6-9min，結束后立即用大量無菌水沖洗3-5遍，之后將外植體放在無菌濾紙上吸干水份，備用；

2)外植體的接種與培養：將處理好的外植體用無菌手術刀均勻切割成1cm²以上的片段；切割完全后，按每個培養皿3個外植體將其均勻接種在預先準備好的愈傷組織誘導培養基上，用封口膜將培養皿封好放入無光照的培養箱進行黑暗培養，之后轉入光照培養箱光照培養；在配置愈傷組織誘導培養基時向愈傷組織誘導培養基中加入1-5mg·L^-1的抗壞血酸；

3)愈傷組織誘導出芽：將長勢良好的愈傷組織分割成米粒大小，按每個培養皿5個均勻接種在含有不同激素及配比的芽誘導培養基上，用封口膜將培養皿封好放入光照培養箱光照培養，培養條件與步驟2)中的光照培養條件相同，培養2周；

4)增殖分化培養：當愈傷組織長出許多不定芽后，將分化較好的愈傷組織轉接入含有不同激素及配比的增殖分化培養瓶中，按照步驟2)中所述的光照培養條件進行培養；經過幾輪繼代培養后，得到大量分化苗；

5)根的誘導：將長勢良好且苗高在2cm的分化苗用無菌手術剪剪下，一苗一株，避開側芽，將其接種到含有不同激素及配比的生根誘導培養基上進行生根誘導培養；培養條件與步驟2)中的所述培養條件所述相同；7d-10d開始出根；

6)煉苗與移栽：在分化苗分化出根后，再培養3周時間，待無菌苗各部位組織器官分化完全且長勢健壯后，將培養瓶放入煉苗室，打開瓶蓋煉苗3d；然后，小心取出試管苗，用自來水洗去根部殘留的培養基，注意不要損傷植株，移栽到組培苗專用營養土中，進行正常化管理，移栽成活率在90％以上。

進一步地，步驟1)中的外植體的滅菌條件為：先用70％酒精浸泡10s，然后再用0.1％HgCl₂浸泡8min。

3、根據權利要求1所述的金龍膽草組織培養方法，其特征在于，所述步驟2)中的培養條件為：在20℃的條件下，黑暗培養3d，之后光照培養3周。

進一步地，步驟2)中的培養條件為：在20℃的條件下，黑暗培養3d，之后光照培養3周。

進一步地，光照培養過程中的光照強度為2000lx，周期為16h/d。

進一步地，步驟2)中的愈傷組織誘導培養基具體是：MS+2,4-D1.0mg·L^-1+6-BA 1.0mg·L^-1+Vc 5.0mg·L^-1。

進一步地，步驟3)中的芽誘導培養基為：MS+NAA 0.1mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1+Vc 5.0mg·L^-1。

進一步地，步驟4)中的增殖分化培養基為：MS+GA₃ 1.0mg·L^-1+Vc5.0mg·L^-1。