[發(fā)明專利]基因倒位突變檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610278323.6
• 申請日: 2016-04-29
• 公開（公告）號: CN107326064A
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜正文;王學(xué)鋒;張希;沈蕾;丁秋蘭;武文漫
• 申請（專利權(quán)）人: 天昊生物醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司;上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海申新律師事務(wù)所31272
• 代理人: 閔東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域的一種基因倒位突變檢測方法。

背景技術(shù)

染色體的斷裂及斷裂后染色體斷端的異常重接是引起染色體結(jié)構(gòu)畸變的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，而倒位(Inversion)是常見的一種染色體結(jié)構(gòu)畸變類型。倒位指染色體上某一區(qū)段連發(fā)生兩次斷裂，中間的片段發(fā)生180度的倒轉(zhuǎn)，然后重接。很多染色體倒位并沒有改變基因的數(shù)目，也沒有對斷點附近的基因造成影響，因此，該類突變的攜帶者擁有正常的表型，但較大區(qū)域的倒位突變可能會在減數(shù)分裂中影響同源染色體的配對從而造成雜合子個體生育能力下降。但有些倒位突變的斷點位于功能基因內(nèi)部或調(diào)控區(qū)附近，會影響改基因的正常表達從而引起疾病(如F8基因22號及1號內(nèi)含子倒位突變)。

對染色體倒位的快速而準確的檢測將有助于醫(yī)學(xué)和遺傳學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)研究和疾病診斷。現(xiàn)有的具體檢測方法可以分為兩大類，一類是全基因組水平上的染色體倒位突變檢測，另一類是對目標區(qū)域進行倒位突變檢測。前者主要為細胞核型分析，該技術(shù)是檢測染色體病最常見的方法，即將待測的細胞的染色體按照該其固有的染色體形態(tài)特征和規(guī)定，進行配對、編號和分組，并進行形態(tài)分析的過程，該技術(shù)在染色體疾病診斷中占據(jù)重要地位。但其存在分辨率較低，操作復(fù)雜，需要專業(yè)人員判讀檢測結(jié)果，需要活細胞培養(yǎng)等不足之處，限制了該技術(shù)在臨床染色體倒位檢測中的應(yīng)用。而后者主要針對特定目標區(qū)段的檢測，包括Southern印跡雜交(Southern blot)技術(shù)(Lakich D et al.,1993)、熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)(Sheen CR et al.,2011)、倒位突變等位基因特異PCR(Liu Q et a.l,1997)以及反向PCR技術(shù)(inverse-PCR)(Rossetti et al.,2005)。

Southern印跡法的基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則特異性地雜交形成雙鏈。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。由于染色體倒位會導(dǎo)致基因序列發(fā)生變化，使用特定的限制性內(nèi)切酶如BclⅠ等對發(fā)生倒位的基因組進行酶切時，產(chǎn)生的酶切片段大小會與正常基因組酶切后片段大小不一致，并可通過Southern印跡法檢測出來。Southern印跡法的應(yīng)用非常廣泛，并被最早使用于血友病F8基因的倒位檢測中，是該疾病檢測倒位的金標準，具有高度特異性及靈敏性。其缺點在于操作復(fù)雜，耗時約一周。之前采用放射性標記物，其靈敏度極高，但是存在著放射性污染及放射核素發(fā)生衰變所產(chǎn)生的不穩(wěn)定性兩大缺點。目前多采用地高辛代替放射性標記物，以避免污染。

熒光原位雜交技術(shù)(FISH，fluorescence in situ hybridization)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)，也可用于染色體的倒位檢測。它的基本原理是：如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。以F8基因第22號內(nèi)含子倒位為例，根據(jù)同源重組區(qū)域位置需要設(shè)計三種BAC克隆探針，RP11-54I20(insert size179.3kb)，RP11-296N8(178.7kb)，RP11-405N23(164kb)，其中RP11-54I20探針可與倒位區(qū)域上游1.25Mb區(qū)域雜交，而RP11-296N8與RP11-405N23則可與倒位發(fā)生區(qū)域雜交，且為區(qū)別信號這兩個探針雜交位置相差150kb，三種探針標記為不同的熒光信號，分別為藍(B)、紅(R)、綠(G)，雜交后通過檢測熒光信號就能知道是否有倒位發(fā)生。若為野生型則熒光信號為BRG，若為倒位則為BGR，攜帶者則這兩種組合的信號都會出現(xiàn)BGR/BRG。熒光原位雜交技術(shù)檢測的結(jié)果判讀直觀快速，具有較高的敏感性與特異性，但也存在一些不足。FISH探針的制備比較耗時與昂貴；對實驗操作的技術(shù)性要求比較高；由于染色體形態(tài)問題，有可能出現(xiàn)無法判讀的情況；且該方法對于男性樣本的陽性檢出靈敏度要高于女性樣本；一般從樣本制備到檢測出結(jié)果需要三天時間，耗時較長。