[發(fā)明專利]一種MIM-I-BAR蛋白提取純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610274871.1
• 申請日: 2016-04-28
• 公開（公告）號: CN105734097B
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發(fā)明（設計）人: 顧寧;張玥;曹萌
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/47;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 鄭立發(fā)

本發(fā)明公開了一種MIM?I?BAR蛋白提取純化方法，包括以下步驟：(1)選擇能夠表達MIM?I?BAR蛋白的表達菌進行培養(yǎng)，促使MIM?I?BAR蛋白表達，收集菌體；(2)取上述菌體，用細胞裂解液重懸細胞，?80℃冷凍；(3)解凍，超聲破碎，離心取上清，過濾；(4)先平衡層析柱，洗去雜蛋白；再次洗去雜蛋白；然后將步驟(3)所得樣品上樣，洗脫目的蛋白，收集蛋白流穿液；(5)將收集的蛋白流穿液超濾離心，去除流穿液，加入PBS離心，得下層沉淀，即為所述MIM?I?BAR蛋白。相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明方法簡單，并且能夠增加蛋白在裂解液中的溶解量，從而避免了包涵體的提取過程；同時大大提高了蛋白的純化效果。

技術領域

本發(fā)明涉及一種MIM-I-BAR蛋白提取純化方法，屬于蛋白純化技術領域。

背景技術

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和腫瘤細胞間或腫瘤細胞與周圍基質細胞間的生物信號傳導異常密切相關，其中相關信號通路之一即Hedgehog通路，相關的靶向藥物研究也是分子腫瘤學的熱點。MIM(Missing in metastasis，也稱MTSS1或BEG4)蛋白是Hedgehog通路的重要響應蛋白，能夠促進Gli蛋白轉錄功能，并調控cillia發(fā)生。蛋白-脂質雙分子膜相互作用是當前脂質體調控和載藥研究的前沿。

MIM I-BAR能夠通過捆扎F-actin而使膜形成絲狀偽足結構。與BAR結構相比，MIMI-BAR的功能則傾向于使膜形成突起而不是形成膜內陷。除了能夠與細胞發(fā)生相互作用，MIM I-BAR還能結合人造磷脂雙分子膜，尤其是富含PI(4,5)P2的磷脂囊泡，并能顯著影響其形態(tài)，使膜表面形成直徑在100nm以內的微的管狀網(wǎng)絡結構，此時蛋白與管狀結構的內側緊密結合，使磷脂雙分子膜凸向囊泡內部。包括與膜結構結合的能力在內，MIM I-BAR的蛋白功能大多都依賴于其自發(fā)的二聚化作用。

近年來，因MIM蛋白與腫瘤遷移密切相關，而逐漸成為研究熱點，對于研究型的蛋白需求擴大，質量上要求卻更加嚴格。MIM-I-BAR在大腸桿菌中主要以包涵體的形式存在，而包涵體的提純較為復雜。

目前，現(xiàn)有技術中尚無針對MIM-I-BAR蛋白的純化方法。而且，現(xiàn)有技術中包涵體的提純較為復雜，且純化效果差。

發(fā)明內容

發(fā)明目的：為了解決上述技術問題，本發(fā)明公開了一種MIM-I-BAR蛋白提取純化方法，為MIM-I-BAR蛋白的生物功能研究提供高純度的研究材料。

技術方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種MIM-I-BAR蛋白提取純化方法，包括以下步驟：

(1)選擇能夠表達MIM-I-BAR蛋白的表達菌進行培養(yǎng)，促使MIM-I-BAR蛋白表達，收集菌體；

(2)取上述菌體，用細胞裂解液重懸細胞，-80℃冷凍；

(3)解凍，超聲破碎，離心取上清，過濾；

(4)先平衡層析柱，然后將步驟(3)所得樣品上樣，洗去雜蛋白，再洗脫目的蛋白，收集蛋白流穿液；

(5)平衡脫鹽柱，加入步驟(4)所得樣品，丟棄流穿液，加入洗脫緩沖液，收集流穿液。

(6)將收集的蛋白流穿液超濾離心，去除流穿液，加入PBS離心，得下層沉淀，即為所述MIM-I-BAR蛋白。

作為優(yōu)選，步驟(1)中所述表達菌為BL21(DE3)大腸桿菌，將人工構建的質粒轉入表達菌中，促使其表達MIM-I-BAR蛋白。

作為另一種優(yōu)選，步驟(2)中所述細胞裂解液為包含：pH 7-8磷酸鈉緩沖液，NaCl，咪唑，PMSF，溶菌酶以及蛋白酶抑制劑；-80℃冷凍時間為12-24h。