[發(fā)明專利]一種阿膠中驢、豬源性巢式熒光PCR檢測(cè)引物、探針組合物、試劑盒及檢測(cè)方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610273963.8
• 申請(qǐng)日: 2016-04-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105734156A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 步迅;張全芳;劉艷艷;范陽(yáng)陽(yáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京中濟(jì)緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 張祥明

1.一種同時(shí)鑒別阿膠中驢、豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測(cè)引物、探針組合物，其特征在于，包括：

(1)多重巢式熒光PCR檢測(cè)驢、豬源性通用外側(cè)引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列：5'CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA3'，如SEQNO.1所示；

反向引物序列：5'TCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCC3'，如SEQNO.2所示；

(2)多重巢式熒光PCR檢測(cè)驢、豬源性通用內(nèi)側(cè)引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列：5'TATGAGTAACAAGAATTATTTCTCC3'，如SEQNO.3所示；

反向引物序列：5'AGCCTGTGTTGGGTTAACAA3'，如SEQNO.4所示；

(3)驢特異性探針，其核苷酸序列如下：

5'CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT3'，如SEQNO.5所示；

(4)豬特異性探針，其核苷酸序列如下：

5'CTCCTCGCACACGCTTACATCAGTA3'，如SEQNO.6所示；

其中，所述驢、豬特異性探針的5’端修飾有報(bào)告基團(tuán)，3’端修飾有淬滅基團(tuán)，所述報(bào)告基團(tuán)為FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一種，所述淬滅基團(tuán)為Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)鑒別阿膠中驢、豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測(cè)引物、探針組合物，其特征在于，還包括內(nèi)標(biāo)質(zhì)控體系，所述內(nèi)標(biāo)質(zhì)控體系包括質(zhì)控體系引物、質(zhì)控體系探針和質(zhì)控體系序列，各核苷酸序列如下：

(1)質(zhì)控體系引物：

上游引物序列如SEQNO.1所示，下游引物如SEQNO.2所示；

(2)質(zhì)控體系探針：

CntP：5'TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT3'，如SEQNO.7所示；

(3)質(zhì)控體系序列：

CCTGTATCAACACATAGAAGCAATATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCGGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA，如SEQNO.8所示；

其中，質(zhì)控體系探針的5’端修飾有報(bào)告基團(tuán)，3’端修飾有淬滅基團(tuán)，所述報(bào)告基團(tuán)為FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一種，所述淬滅基團(tuán)為Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一種。

3.一種同時(shí)鑒別阿膠中驢、豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1或2所述的同時(shí)鑒別阿膠中驢、豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測(cè)引物、探針組合物，以及阿膠DNA提取液和多重巢式熒光PCR反應(yīng)所需試劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的同時(shí)鑒別阿膠中驢、豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括驢、豬陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照品和空白對(duì)照品。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的同時(shí)鑒別阿膠中驢、豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述多重巢式熒光PCR反應(yīng)所需試劑包括：多重巢式熒光PCR反應(yīng)緩沖液2×qPCRMasterMix，Taq熱啟動(dòng)酶，鎂離子濃度2.0mM，4種dNTP的終濃度各為200μM，Tris-H2SO4pH9.0終濃度為300mM，KCl終濃度為600mM，終濃度為5M/L的甜菜堿和超純水；所述試劑盒為20μlPCR反應(yīng)擴(kuò)增體系：2×qPCRMasterMix10μl，外側(cè)引物對(duì)10μM取0.5μl，內(nèi)側(cè)引物對(duì)10μM取1μl，探針用量10μM取0.5μl，DNA用量1-50ng/μl取2μl，用雙蒸水補(bǔ)足20μl。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的同時(shí)鑒別阿膠中驢、豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的PCR擴(kuò)增步驟為兩步：第一步反應(yīng)外側(cè)引物優(yōu)先擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃10min，95℃10s，70℃，35s，在此收集熒光信號(hào)，15個(gè)循環(huán)；第二步反應(yīng)內(nèi)側(cè)引物優(yōu)先擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃10s，60℃，35s，在此收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。