[發明專利]一種快速檢測食品中大腸桿菌O157:H7的試劑盒

在審

• 申請號: 201610272861.4
• 申請日: 2016-04-28
• 公開（公告）號: CN105695623A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 勵建榮;張德福;張明;方亞琴;儀淑敏;李春;李婷婷;于志鵬;白鳳翎;趙麗紅;付緒磊
• 申請（專利權）人: 渤海大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種快速檢測食品中大腸桿菌O157:H7的試劑盒，其特征是：

該試劑盒包含：無菌去離子水、PCR反應預混液、對照品和DNA染料；

所述PCR反應預混液含有PCR反應緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶，檢測 用引物；

所述檢測用引物為大腸桿菌O157:H7的特異性引物rfbEF、rfbEBR和擴增內標引物27F、 1492R，其序列分別為：

rfbEF：CTACTGTAAGTAATGGAACGGTTGC；

rfbER：TGCGGTCCTAGTTAGAATTGAGACC；

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；

1492R：TACGGYTACCTTTGTTACGACTT；

所述對照品分為陰性對照品和陽性對照品，陰性對照品模板為無菌去離子水，陽性對 照品模板為rfbEF和rfbER的擴增產物連接至T載體后獲得的質粒基因組。

2.根據權利要求1所述的一種快速檢測食品中大腸桿菌O157：H7的試劑盒，其特征是： 擴增內標引物27F和1492R的終濃度均為0.4mM。

3.根據權利要求1所述的一種快速檢測食品中大腸桿菌O157：H7的試劑盒，其特征是： 所述大腸桿菌O157H7的特異性引物序列為rfbEF：CTACTGTAAGTAATGGAACGGTTGC和rfbER： TGCGGTCCTAGTTAGAATTGAGACC。

4.根據權利要求3所述的一種快速檢測食品中大腸桿菌O157：H7的試劑盒，其特征是： 所述大腸桿菌O157:H7的特異性引物rfbEF和rfbER的終濃度均為0.4mM。

5.根據權利要求1所述的一種快速檢測食品中大腸桿菌O157：H7的試劑盒，其特征是：

使用本試劑盒快速檢測食品中大腸桿菌O157：H7的方法是：

（1）樣品的采集：無菌采集可疑食品；

（2）增菌培養：將采集的可疑食品混合均勻后無菌取樣，液體食品直接量取，固體食品 放入無菌研缽、組織研磨器或均質袋內均質2～5min，加入無菌營養肉湯培養基，37±1℃ 振蕩培養6～8h，得到增菌液；

（3）DNA提取：取培養后的增菌液，振蕩混勻，取1ml于離心管中1000～1500r/mim離心 1～2min，除去較大塊的碎片，取上清8000～12000r/mim離心1～2min，傾去上清液，倒置 于吸水紙上不同的位置，吸干殘留液體，再用無菌去離子水重懸、洗滌沉淀，8000～12000 r/mim離心1～2min，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，沸水浴5～10min，冰浴5～10 min，1000～5000r/mim離心5～10min，上清液即為樣品模板DNA，調整濃度至約為10～30 ng/μl備用，或-20℃保存；

（4）PCR反應管制備：PCR反應管的制備及PCR反應預混液的融化置于冰上進行；依次取 PCR反應預混液24μl，樣品模板DNA1μl，加入至無菌PCR反應管中混合均勻，制得樣品模 板DNA的PCR反應管；然后制備陰性對照品和陽性對照品的PCR反應管，直接取相應管中預混 液25μl即可；每擴增一次，陰性對照和陽性對照都至少各有1管；

（5）擴增檢測：將制備的樣品模板DNA、陰性對照品、陽性對照品的PCR反應管置于PCR儀 上進行PCR擴增，得PCR擴增產物；

（6）取1g瓊脂糖溶于100ml電泳緩沖液中，混合均勻后煮沸，冷卻，加入DNA染料，傾倒凝 膠板；凝膠冷卻凝固后，將PCR擴增產物5μl加入凝膠孔中進行電泳；電泳結束后，將凝膠放 置于紫外燈下觀察，判定結果；（a）陽性對照的凝膠孔有約1500bp和約750bp的2條電泳條帶 而陰性對照的凝膠孔無任何條帶，則PCR反應檢測成功；（b）若陰性對照有2條帶，說明PCR反 應管制備過程中有交叉污染，結果不可靠，建議重新進行PCR檢測；（c）陽性對照有2條帶，陰 性對照沒有條帶，被檢樣品的凝膠孔只出現1條約1500bp的電泳條帶與陽性對照的凝膠孔 相應條帶大小一致，則結果判斷為陰性；（d）被檢樣品的凝膠孔出現的2條電泳條帶與陽性 對照的凝膠孔中相應條帶大小一致，陰性對照無條帶，則判定為被檢樣品陽性；（e）陽性對 照的凝膠孔有2條電泳條帶，陰性對照的凝膠孔無任何條帶，而被檢樣品的凝膠孔沒有約 1500bp的電泳條帶則說明樣品處理過程中存在酶抑制劑，建議換其他方法進行樣品處理； （f）陽性對照沒有條帶，說明試劑盒失效，本次檢測結果無效。