[發明專利]一種四重RT-PCR同時檢測多種辣椒病毒的方法及其應用

在審

• 申請號: 201610272621.4
• 申請日: 2016-04-27
• 公開（公告）號: CN105755177A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 胡新喜;汪沛;熊興耀
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所 11039
• 代理人: 劉江良

1.一種四重RT-PCR同時檢測四種常見辣椒病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）取待測辣椒幼嫩葉片，提取其RNA；

2）以步驟1）得到的RNA為模板，通過反轉錄得到cDNA；

3）以步驟2）得到的cDNA為模板，用四對引物對其進行四重PCR擴增；

4）PCR產物凝膠電泳，凝膠成像系統拍照，根據目的片段大小及陽性對照，判斷病毒感染情況；

其中所用的四對引物的序列如下：

1）檢測黃瓜花葉病毒的引物：

正向引物：CCCACTCTTAACCACCCAACC

反向引物：GACGCAGCATACTGATAAACCAA

2）檢測煙草花葉病毒的引物：

正向引物：TAGACCCGCTAGTCACAG

反向引物：CAGAGGTCCAAACCAAAC

3）檢測馬鈴薯Y病毒的引物：

正向引物：ACGTCCAAAATGAGAATGCC

反向引物：TGGTGTTCGTGATGTGACCT

4）檢測蠶豆萎蔫病毒-2的引物：

正向引物：GCCAGAACTTGGGAGTGATAC

反向引物：ACTTGTTAGCCATTCGGGTC。

2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：四重PCR擴增條件為：四重PCR反應體系（50μl）：2×PCRmix25μl、模板（cDNA）4μl、四對引物的正向引物和反向引物各2μl、超純水補至所需體積。

3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于，其中四重PCR擴增程序：94℃5min預變性后，40個循環參數為，94℃30s，53℃40s，72℃1min，最后72℃10min。

4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，第1步是取田間花葉癥狀的辣椒幼嫩葉片，冰上保存，采取Trizol方法提取RNA。

5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，第2步是以步驟1）得到的RNA為模板，以6堿基隨機引物RandomPrimers為反向引物，通過反轉錄，得到cDNA。

6.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，第4步的判斷標準是：如果擴增獲得323bp的片段，則表明待測辣椒感染了黃瓜花葉病毒；如果擴增獲得237bp的片段，則表明待測辣椒感染了煙草花葉病毒；如果擴增獲得480bp的片段，則表明待測辣椒感染了馬鈴薯Y病毒；如果擴增獲得1057bp的片段，則表明待測辣椒感染了蠶豆萎蔫病毒-2。