[發明專利]一種阿膠中驢、牛源性巢式熒光PCR檢測引物、探針組合物、試劑盒及檢測方法與應用

在審

• 申請號: 201610272510.3
• 申請日: 2016-04-28
• 公開（公告）號: CN105755145A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 步迅;張全芳;劉艷艷;范陽陽
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院生物技術研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 張祥明

技術領域

本發明涉及一種膠類中藥動物源性檢測技術領域，具體涉及一種阿膠中驢、牛源性巢式熒光PCR檢測引物、探針組合物、試劑盒及檢測方法與應用，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

阿膠為馬科動物驢的皮，經煎煮、濃縮制成的固體膠，原產自山東省泛東阿區，始載于《神農本草經》，與人參、鹿茸并稱為“滋補三寶”，至今已有近三千年歷史。阿膠補血圣藥，味甘平，入肺、肝、腎經，具有補血止血、滋陰潤燥等功效，藥食兩用，長期服用可補血養血、美白養顏、抗衰老、抗疲勞、提高免疫力，適用人群廣泛。李時珍著《本草綱目》載：“阿膠《本經》上品。

2015版《中國藥典》明確規定阿膠為馬科動物驢(EquusanimusL.)的皮熬制而成的阿膠為正品阿膠。然而隨著膠類市場的不斷發展，隨著熬膠原料供應緊張和價格上漲，由于阿膠功效獨特，市場供不應求，摻假偽劣產品層出不窮，并不斷被媒體曝光。這些劣質阿膠多采用牛、馬、騾子、豬、羊等動物皮、骨、結締組織熬制，用肉眼難以鑒別，《中國藥典》通過驢的特征態測驢源成分，已不能滿足鑒別雜皮源的需求。偽劣阿膠在臨床使用后不僅達不到治療效果，還對消費者健康安全帶來巨大隱患。為了取締和預防假冒偽劣阿膠產品，需要質量監管部門加大執法力度，而首要前提是具備科學可靠的檢測方法。

傳統的巢式PCR反應由于有2次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶點的可能性，增加了檢測的靈敏度和可靠性，主要應用于分子生物學領域和醫學檢測研究中。但也有耗時長、易污染和假陽性等缺點，即從PCR擴增開始全程耗時約5h，檢測結果需要電泳及凝膠成像系統才能看到結果，多次開管操作，交叉污染的可能性大。

此外，由于阿膠經過多個工序的高溫煎煮，導致線性基因組DNA斷裂成小片段，甚至降解掉，雖然環狀線粒體DNA對高溫的耐受力相對線性基因組DNA較強，但阿膠經過深度加工后都會對DNA不同程度的破壞，如何解決降解DNA成為基于DNA檢測技術來檢測阿膠真偽的一大瓶頸。中國專利(CN104988231.A)利用半巢式PCR技術鑒別阿膠真偽，擴增片段700bp左右，對于深度加工的膠類中藥來將，DNA已高度破壞，大片段擴增很難成功，加上需要兩輪PCR擴增，不但耗時、開管操作極易造成交叉污染導致假陽性及結果的準確性低，所以傳統PCR檢測方法已經不能滿足當前阿膠真偽檢測的要求。

發明內容

針對現有技術存在的不足，本發明的目的是提供一種阿膠中驢、牛源性巢式熒光PCR檢測引物、探針組合物、試劑盒及檢測方法與應用，該試劑盒檢測靈敏度高、特異性好，可以實現阿膠中驢、牛源性成分快速定性檢測；該檢測方法快速簡便、準確度高。

為實現上述目的，本發明通過以下技術方案來實現：

一種同時鑒別阿膠中驢、牛源性成分的多重巢式熒光PCR檢測引物、探針組合物，包括：

(1)多重巢式熒光PCR檢測驢、牛源性通用外側引物，其擴增片段為220bp，其核苷酸序列如下：

正向引物序列：5'CCCTGGACTATTCTATCAACACATCG3'(Tm值63.4℃)，如SEQNO.1所示；

反向引物序列：5'GTTTGCCGAGTTCCTTTTACTTCTTT3'(Tm值63.4℃)，如SEQNO.2所示；

(2)多重巢式熒光PCR檢測驢、牛源性通用內側引物，其擴增片段為82bp，其核苷酸序列如下：

正向引物序列：5'TTTCTCCTCGCATAAGCCT3'(Tm值55.1℃)，如SEQNO.3所示；

反向引物序列：5'ATAGTTAGTTTTTGGGTTGTGTCT3”(Tm值54.6℃)，如SEQNO.4所示；

(3)驢特異性探針，其核苷酸序列如下：

5'CAACAAAATAGACACAACCCAAAATGTTG3'，如SEQNO.5所示；

(4)牛特異性探針，其核苷酸序列如下：

5'TTCTCCTTGCATAAGTCTAAGTCAGTGC3'，如SEQNO.6所示；

其中，所述驢、牛特異性探針的5’端修飾有報告基團，3’端修飾有淬滅基團，所述報告基團為FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一種，所述淬滅基團為Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一種。

本發明還可以具有以下附加技術特征：

進一步的，驢特異探針序列(SEQNO:5)為：

5'JOE-CAACAAAATAGACACAACCCAAAATGTTG-BHQ13'；