[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌突變菌的構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610272266.0
• 申請(qǐng)日: 2016-04-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105754922A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王瑞明;汪俊卿;王蕾;王騰飛;李桂華;王建彬;隋松森
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 齊魯工業(yè)大學(xué);諸城東曉生物科技有限公司;山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/87;C12P13/08;C12R1/15
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌突變菌的構(gòu)建方法，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

L-賴氨酸是人體必需氨基酸之一，能促進(jìn)人體發(fā)育、增強(qiáng)免疫功能，并有提高中樞神經(jīng)組織功能的作用。L-賴氨酸為白色或近白色自由流動(dòng)的結(jié)晶性粉末；幾乎無(wú)臭。易溶于水和甲酸，難溶于乙醇和乙醚。L-賴氨酸分子結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)氨基堿性較強(qiáng)，C4位上的羧基酸性較弱，因此L-賴氨酸一般表現(xiàn)為堿性氨基酸。L-賴氨酸主要用作飼料添加劑、食品強(qiáng)化劑和制藥。

目前，可以通過(guò)不同的方法來(lái)生產(chǎn)L-賴氨酸，包括微生物發(fā)酵法(一步發(fā)酵法、兩步發(fā)酵法)、酶法、蛋白水解法等。最常用的方法是微生物發(fā)酵法，是借助微生物具有生物合成自身所必需氨基酸的能力，利用微生物的代謝作用，通過(guò)對(duì)菌株進(jìn)行改造，選育出各種氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型和氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，從而解除生物合成途徑中的反饋?zhàn)瓒艉鸵种谱饔茫_(dá)到過(guò)量積累代謝途徑中L-賴氨酸的目的。

用于生產(chǎn)L-賴氨酸的微生物包括多種屬，如棒狀桿菌(如谷氨酸棒狀桿菌Corynebacteriumglutamicum和鈍齒棒桿菌Corynebacteriumcrenatum)、短桿菌(如黃色短桿菌Breibacteriumflavum和乳酸發(fā)酵短桿菌Brevibacteriumlactofermentus)、洛卡氏菌、念球菌、假單胞菌、埃希氏菌(如大腸桿菌Escherichiacoli)和芽孢桿菌(如浸麻芽孢桿菌Bacillusmacerans)、古生菌(如熱變形菌Thermoprotensneutrophilus)以及真菌中的酵母菌(如隱球酵母Cryptococcusneoformans)等。目前，國(guó)內(nèi)外用于工業(yè)化生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株多為谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)、黃色短桿菌(B.flavum)、乳酸發(fā)酵短桿菌(B.lactofermentus)和大腸桿菌(E.coli)的改造型菌株。國(guó)內(nèi)外對(duì)L-賴氨酸生產(chǎn)菌種的選育主要通過(guò)誘變育種技術(shù)和代謝工程育種技術(shù)。代謝工程育種是從分子水平上通過(guò)最小限度的、最明確的基因改造來(lái)優(yōu)化選育菌株。然而，與野生型菌株相比較，這些菌株存在很大的缺陷，如生長(zhǎng)速度緩慢，糖耗速率低，對(duì)外界不良環(huán)境耐受力差等。隨著生物技術(shù)的發(fā)展及谷氨酸棒狀桿菌基因組的解析，傳統(tǒng)誘變育種獲得L-賴氨酸高產(chǎn)菌方法逐漸被代謝工程育種方法所取代。同時(shí)大量研究表明，通過(guò)基因工程技術(shù)獲得的基因工程菌，除保留了野生型菌株的一些優(yōu)點(diǎn)外，還能很大程度上提高L-賴氨酸產(chǎn)量。如中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1539015(申請(qǐng)?zhí)?2815446.0)公開(kāi)了包括accBC、accDA、catA、cysD、cysE在內(nèi)的多個(gè)可用于賴氨酸產(chǎn)量提高的基因改進(jìn)位點(diǎn)。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101600796(申請(qǐng)?zhí)?00780048626.8)、CN1974760(申請(qǐng)?zhí)?00610163142.5)、CN103243042(申請(qǐng)?zhí)?01310092638.8)分別對(duì)基因NCg22534、NCgl1835、NCg21090進(jìn)行失活獲得一系列L-賴氨酸產(chǎn)率提高的谷氨酸棒狀桿菌工程菌。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌突變菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明通過(guò)改造菌株谷氨酸棒狀桿菌獲得，具體策略為失活谷氨酸棒狀桿菌內(nèi)源基因NCgl0929(編碼賴氨酸胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)以降低賴氨酸發(fā)酵過(guò)程中賴氨酸胞內(nèi)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)的冗余循環(huán)，使更多的能量流向L-賴氨酸合成方向，提高L-賴氨酸產(chǎn)率。

術(shù)語(yǔ)說(shuō)明

本發(fā)明中，“失活”可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何失活方法來(lái)誘導(dǎo)。“失活”產(chǎn)生的效果是指內(nèi)源基因NCgl0929的表達(dá)被降低到很低的水平，或者產(chǎn)生不表達(dá)基因以及盡管被表達(dá)但表達(dá)不具有活性或活性降低的產(chǎn)物。

本發(fā)明中，“失活”可以通過(guò)基因工程手段在內(nèi)源基因NCgl0929中插入一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)，或者缺失該內(nèi)源基因NCgl0929中的一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)，或者由基因內(nèi)部序列轉(zhuǎn)換或顛換獲得。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌突變菌的構(gòu)建方法，是將谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的NCgl0929基因失活后構(gòu)建獲得，NCgl0929基因編碼框的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)來(lái)源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)CICC23604。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述構(gòu)建方法，步驟如下：