[發(fā)明專利]基因工程生物指示劑

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610270625.9
• 申請(qǐng)日: 2016-04-27
• 公開（公告）號(hào): CN105907632B
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王衛(wèi);周平樂
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京巨鯊顯示科技有限公司;南京巨鯊醫(yī)療科技有限公司;南京巨鯊商貿(mào)有限公司
• 主分類號(hào): C12M1/34
• 分類號(hào): C12M1/34;C12R1/125;C12R1/07;C12R1/145
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及屬于消毒滅菌生物指示劑領(lǐng)域，尤其涉及用于一種或多種滅菌效力且用于生物監(jiān)測(cè)的一種基因工程生物指示劑。

背景技術(shù)

在醫(yī)療保健行業(yè)，衛(wèi)生檢疫行業(yè)，制藥企業(yè)等多種涉及無菌技術(shù)的行業(yè)，常常有必要對(duì)各種無菌生產(chǎn)工藝、 無菌產(chǎn)品、 無菌包裝材料等滅菌效果進(jìn)行評(píng)估驗(yàn)證，檢測(cè)設(shè)備的滅菌效力。世界各地每年都會(huì)有因滅菌不徹底導(dǎo)致感染事件發(fā)生的報(bào)道。生物檢測(cè)即是通過標(biāo)準(zhǔn)化的菌株，其合乎要求的抗力來考核滅菌負(fù)荷是否達(dá)到無菌保障水平的要求。

目前國(guó)內(nèi)外廣泛使用的生物指示劑為通用型生物指示劑和快速型生物指示劑。通用型生物指示劑是依據(jù)芽胞恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)，新陳代謝產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物引起培養(yǎng)基pH變化，通過添加pH指示劑如溴甲酚紫，根據(jù)其顏色變化來判讀結(jié)果。微生物培養(yǎng)時(shí)間為24h~48h。通用型生物指示劑結(jié)果可靠，但耗時(shí)較久，無法達(dá)到快速判讀的標(biāo)準(zhǔn)，在臨床應(yīng)用中有極大的限制。快速型生物指示劑，主要依據(jù)芽胞恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生的α-葡萄糖苷酶，水解底物產(chǎn)生熒光物質(zhì)，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化判讀滅菌結(jié)果。α-葡萄糖苷酶是芽胞恢復(fù)生長(zhǎng)所必須的水解酶，存在于芽胞外壁中，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中也有該酶存在。通過對(duì)酶水解底物產(chǎn)生的熒光物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，可達(dá)到在1h~3h內(nèi)讀取結(jié)果，進(jìn)而縮短讀取到滅菌失敗的結(jié)果的時(shí)間。但是由于通過間接檢測(cè)酶的性質(zhì)，來判讀結(jié)果，而研究發(fā)現(xiàn)該酶的耐熱性比芽胞更強(qiáng)。因此導(dǎo)致芽胞已滅活而酶依舊存在并保持其活力的情況發(fā)生。

基因工程生物指示劑通過直接檢測(cè)基因水平的表達(dá)，來確定滅菌結(jié)果。該方法直接檢測(cè)芽胞的生命狀態(tài)，可有效解決酶與芽胞活力狀態(tài)不一致的問題。US8372624B2專利公開了一種基因工程生物指示劑，該生物指示劑攜帶有阻遏基因和報(bào)告基因。當(dāng)微生物暴露于誘導(dǎo)劑中時(shí)，報(bào)告基因表達(dá)，轉(zhuǎn)錄翻譯出指示酶。指示酶與特異性酶底物作用，產(chǎn)生熒光物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。傳統(tǒng)的報(bào)告基因如CAT氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，beta-Gal，beta-半乳糖苷酶等，由于其本身不能發(fā)光，需添加特異性酶底物，才可檢測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá)。應(yīng)用此類報(bào)告基因同時(shí)也存在酶底物透膜速率慢，熒光強(qiáng)度與酶活力關(guān)系密切等缺點(diǎn)。而熒光蛋白家族在成熟蛋白質(zhì)形成后，可自發(fā)熒光，無需同特異性酶底物作用，即可進(jìn)行熒光光強(qiáng)檢測(cè)，來判斷滅菌結(jié)果。US8372624 B2專利也公開了以GFP綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因的基因工程生物指示劑。野生型綠色熒光蛋白GFP，缺乏酶促放大作用，熒光信號(hào)相對(duì)較弱，靈敏度較低。

WO2014149379 A1專利在上述專利的基礎(chǔ)上，減少阻遏基因，來降低基因工程生物指示劑的復(fù)雜性。若減少阻遏基因，則該基因在非誘導(dǎo)情況下也會(huì)表達(dá)，同樣也會(huì)存在酶的耐熱性與芽胞耐熱性不一致的現(xiàn)象的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于針對(duì)上述存在的問題與不足，提供一種基因工程生物指示劑，以無害，高靈敏度的一種或多種突變體熒光蛋白作為報(bào)告基因，上游采用高轉(zhuǎn)錄活性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子上游添加選擇性標(biāo)記基因?qū)赀M(jìn)行篩選。

本發(fā)明通過基因工程技術(shù)手段將上述外源基因?qū)胫甘疚⑸镏校庠椿虬▎?dòng)子，報(bào)告基因和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因位于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子上游，報(bào)告基因位于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子下游。在無誘導(dǎo)物存在下，選擇性標(biāo)記基因表達(dá)，報(bào)告基因無表達(dá)，用于篩選轉(zhuǎn)染成功的菌株。經(jīng)過滅菌因子暴露后，指示微生物同誘導(dǎo)物相接觸，報(bào)告基因表達(dá)。

本發(fā)明中基因工程生物指示劑在誘導(dǎo)物的存在下，從啟動(dòng)子處開始轉(zhuǎn)錄及翻譯，表達(dá)出報(bào)告基因。此類報(bào)告基因具有獨(dú)特的優(yōu)異性，無需特異性酶底物，可自發(fā)熒光，同時(shí)也具有較高的性噪比，熒光信號(hào)強(qiáng)，易檢測(cè)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的存在，保證基因在非誘導(dǎo)情況下無表達(dá)，防止生物體在滅菌之前表達(dá)熒光蛋白，蛋白質(zhì)與芽胞不同的抗熱性能影響滅菌后結(jié)果的判讀。

為達(dá)成上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種基因工程生物指示劑，其包括：

菌片，其均勻分布有指示微生物；

內(nèi)層包裝，其確保菌片在保存時(shí)處于無菌環(huán)境，同時(shí)在滅菌過程中有效滅菌因子同菌片接觸；

安瓿瓶，其內(nèi)部密封有芽胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)物，其中芽胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)物在滅菌過程中與菌片分開，而在滅菌結(jié)束后允許同菌片接觸。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步包括如下附屬技術(shù)方案：

所述指示微生物包括嗜熱脂肪芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，短小芽胞桿菌，生孢梭菌，枯草芽胞桿菌黑色變種芽胞中的一種或多種。

所述指示微生物為細(xì)菌芽胞。

所述指示微生物為經(jīng)過基因工程改造的指示微生物。