[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于肽核酸探針的酪蛋白激酶-1基因突變檢測(cè)試劑及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610270438.0
• 申請(qǐng)日: 2016-04-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105695619A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐景峰;周策凡;陳興珍;張毅;秦文英
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖北工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及臨床分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于肽核酸探 針的酪蛋白激酶-1(CK1)基因突變檢測(cè)試劑、PCR檢測(cè)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

Wnt信號(hào)通路廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中，是一類(lèi)在物種進(jìn)化過(guò)程中高 度保守的信號(hào)通路。Wnt信號(hào)在動(dòng)物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其它生理過(guò)程 中，具有至關(guān)重要的作用。如果這條信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白發(fā)生突變或者異常表達(dá)，導(dǎo)致信 號(hào)異常活化，就可能誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生。Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路與非經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路，在經(jīng)典通路即Wnt-β-catenin信號(hào)通路中，Wnt因子通過(guò)激活細(xì)胞膜上的 Frizzle/LRP5/6協(xié)同受體后抑制細(xì)胞內(nèi)游離β-catenin蛋白的磷酸化和降解，細(xì)胞質(zhì)中的 β-catenin蛋白水平升高后將發(fā)生β-catenin蛋白的核移位，導(dǎo)致細(xì)胞核中β-catenin蛋白 升高，胞核中β-catenin蛋白能夠聯(lián)合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同與TCF/LEF-1轉(zhuǎn)錄因 子家族形成復(fù)合體并激活Wnt信號(hào)通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。

CK1蛋白是Wnt信號(hào)通路中β-catenin上游重要成員之一。其主要作用是能夠與 Axin2、GSK3β、APC等蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的降解。目前越來(lái)越多 的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在很多腫瘤中CK1蛋白均呈現(xiàn)不同程度的突變。

目前研究核心信號(hào)通路的核心分子調(diào)控機(jī)制，以及某些重要成員在細(xì)胞中的表達(dá) 水平，已經(jīng)成為治療腫瘤的一種關(guān)鍵手段，近年來(lái)Wnt信號(hào)通路在癌癥中的研究，以及CK1蛋 白作為Wnt信號(hào)通路重要成員其突變水平的研究，已經(jīng)成為研究開(kāi)發(fā)腫瘤藥物急需解決的 重要問(wèn)題，尤其是在CK1基因激酶結(jié)構(gòu)域中發(fā)生的突變，對(duì)CK1蛋白發(fā)揮功能起著非常重要 的作用，例如在睪丸生殖細(xì)胞癌細(xì)胞中檢測(cè)出G72DS突變，肝癌細(xì)胞中檢測(cè)出F101L突變等。

肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)是一類(lèi)以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA 類(lèi)似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎(chǔ)上，通過(guò)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)構(gòu)建并最終人工合成的 第三代反義試劑，是一種全新的DNA類(lèi)似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代 了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)的 形式識(shí)別并結(jié)合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶負(fù)電荷，與DNA和RNA 之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的 雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠(yuǎn) 優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識(shí)別能力、不被核酸酶 和蛋白酶水解。

本方法采用特異序列的PNA寡聚物作為探針。由于PNA是一種人工合成的核酸的類(lèi) 似物，并且為非手性、不帶電荷的分子，避免了寡核苷酸與其靶基因結(jié)合時(shí)因電荷相互排斥 所導(dǎo)致的雜交不穩(wěn)定性，結(jié)合不易受雜交液離子強(qiáng)度的影響，從而顯示出極強(qiáng)的雜交優(yōu)勢(shì)， 大大提高了檢測(cè)靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中如何確定Wnt信號(hào)通路中核心的信號(hào)分子CK1基 因突變情況，以及如何解釋核心分子CK1在腫瘤細(xì)胞中的突變水平變化的困難，提供了一種 檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中CK1基因突變檢測(cè)試劑、PCR檢測(cè)方法及應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是提供一種用于酪蛋白激酶-1(CK1)基因突變檢測(cè)的試劑，包括用 于阻斷野生型CK1基因擴(kuò)增的野生型PNA序列、用于特異性擴(kuò)增G72D、F101L突變型CK1基因 序列的一組引物對(duì)及突變型PNA熒光探針：

所述檢測(cè)CK1基因G72D突變正向引物如序列表中SEQIDNO.1；

所述檢測(cè)CK1基因G72D突變反向引物如序列表中SEQIDNO.2；

所述檢測(cè)CK1基因F101L突變正向引物如序列表中SEQIDNO.3；

所述檢測(cè)CK1基因F101L突變反向引物如序列表中SEQIDNO.4；

所述檢測(cè)CK1基因G72D突變PNA熒光探針如序列表中SEQIDNO.5；

所述檢測(cè)CK1基因F101L突變PNA熒光探針如序列表中SEQIDNO.6；